中藥冬蟲(chóng)夏草的鑒別研究

中藥冬蟲(chóng)夏草的鑒別研究

甘草是麥角菌科的一種真菌甘草。寄生蟲(chóng)位于蝙蝠科昆蟲(chóng)蟲(chóng)的頭部和幼體的干燥部位。它是新的。它具有補(bǔ)充肺、益腎、止血和粘液的功效。治療肺虛、咳嗽、出血和地方志。它是我國(guó)著名的預(yù)防疾病之一。冬蟲(chóng)夏草的生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特,分布區(qū)域有限,僅產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、四川西部及甘肅南部地區(qū)海拔3000米以上的高原地帶,生長(zhǎng)周期2~3年,目前尚沒(méi)有實(shí)現(xiàn)人工栽培。由于有限的野生資源與巨大的市場(chǎng)需求,冬蟲(chóng)夏草成為我國(guó)目前價(jià)格最為昂貴的名貴滋補(bǔ)中藥。資源短缺也導(dǎo)致藥用市場(chǎng)上冬蟲(chóng)夏草混偽品現(xiàn)象嚴(yán)重,常見(jiàn)混淆品如亞香棒蟲(chóng)草(C.barnesii)、新疆蟲(chóng)草(C.grsacilis)、北蟲(chóng)草(C.militaris)等,因此科學(xué)準(zhǔn)確的進(jìn)行冬蟲(chóng)夏草的真?zhèn)舞b別十分迫切而重要。近年來(lái),有關(guān)冬蟲(chóng)夏草極其混淆品的鑒別研究也有一些報(bào)道［2-7］,但是鑒別方法多局限于傳統(tǒng)的生藥學(xué)鑒別,在應(yīng)用上具有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)在性狀、顯微鑒別的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用DNA分子鑒別技術(shù),在基因水平對(duì)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行鑒別研究,為冬蟲(chóng)夏草的鑒別提供新的科學(xué)依據(jù)。1ssr-pcr檢測(cè)野生冬蟲(chóng)夏草、亞香棒蟲(chóng)草、新疆蟲(chóng)草分別采集于我國(guó)西藏、青海、新疆等省區(qū),經(jīng)香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心董婷霞博士鑒定學(xué)名,樣品現(xiàn)存放于香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心。DNeasyPlantMiniKit試劑盒(QIAGEN公司);WizardTMPCRPrepsDNAPurificationSystem(Pro-mega公司);TaqDNA聚合酶(Progema公司);dNTP(Progema公司);DNAMarker(MBIFermentas公司)。Olympus光學(xué)顯微鏡(Olympus公司);PCRSystem9700(PE公司);DU-640核酸蛋白分析儀(BECKMAN公司);蛋白核酸成像儀(PharmaciaBiotech公司)。2方法2.1設(shè)計(jì)臨時(shí)中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)聯(lián)點(diǎn)在性狀鑒別與藥材數(shù)碼成像拍攝的基礎(chǔ)上,采用石蠟制片法分別制作冬蟲(chóng)夏草子座可孕部位和蟲(chóng)體橫切面永久制片,采用粉末制片法制作冬蟲(chóng)夏草粉末臨時(shí)制片,光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察組織橫切面特征與藥材粉末特征,數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝主要顯微鑒別特征。2.2rapd片段的純化及純化2.2.1DNA的提取、RAPD分析冬蟲(chóng)夏草及其混淆品的DNA提取、RAPD分析見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的方法。2.2.2特異性RAPD擴(kuò)增片段(RAPD-SCAR)克隆測(cè)序?qū)Χx(chóng)夏草的特異性RAPD擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收純化,純化片段與pGEM-T載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行序列分析。2.2.3SCAR-PCR標(biāo)記鑒別引物的設(shè)計(jì)與鑒別條件的建立用Primerpremier5.0軟件從RAPD-SCAR序列的兩端分別設(shè)計(jì)上下游引物。通過(guò)對(duì)鑒別PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立PCR鑒別反映參數(shù):①94℃預(yù)變性5min;②94℃變性1min;③65℃復(fù)性30s;④72℃延伸45s;⑤重復(fù)②~④步驟共27個(gè)循環(huán);⑥72℃保溫3min。3結(jié)果3.1子座與子囊殼特征3.1.1性狀鑒別冬蟲(chóng)夏草由蟲(chóng)體與從蟲(chóng)頭部長(zhǎng)出的真菌子座相連而成。蟲(chóng)體似蠶,長(zhǎng)3~5cm,直徑3~8mm;表面深黃色至黃棕色,有環(huán)紋20~30個(gè),近頭部的環(huán)紋較細(xì);頭部紅棕色,足8對(duì),中部4對(duì)較明顯;質(zhì)脆,易折斷,斷面略平坦,淡黃白色,有時(shí)中間有一個(gè)近“V”形或不規(guī)則形狀的灰黑色芯。子座細(xì)長(zhǎng)圓柱形,長(zhǎng)4~7cm,直徑2.5~3.5mm;表面深棕色至棕褐色,有細(xì)縱皺紋,上部稍膨大;質(zhì)柔韌,斷面類(lèi)白色。氣微腥,味微苦(圖1)。3.1.2顯微鑒別橫切面特征:子座可孕部位橫切面:近圓形,內(nèi)部充滿(mǎn)了密集的菌絲。子囊殼呈卵圓形或橢圓形,分布于子座表面,子囊殼內(nèi)有多數(shù)線(xiàn)形的子囊,子囊殼間由密集的菌絲相連(圖2)。蟲(chóng)體橫切面:近圓形或不規(guī)則形,中間有一個(gè)近“V”形或不規(guī)則形狀的芯。外側(cè)為體壁,內(nèi)為大量的菌絲,其間有裂隙。體表著生很多長(zhǎng)短不一的剛毛(圖2)。粉末特征:呈棕色,蟲(chóng)體體壁碎片淺黃色或淺棕黃色,密布瘤狀突起;剛毛極多,長(zhǎng)刺狀或短刺狀,有的可見(jiàn)剛毛脫落以后留下的小凹窩。蟲(chóng)體碎片成片分布,有的與棕色的體壁相連,淡灰色,細(xì)胞界限不明顯,內(nèi)充滿(mǎn)圓形的顆粒物。子座碎片成片分布,有的與棕色的子座表皮相連,充滿(mǎn)密集的菌絲,菌絲淡灰色,細(xì)長(zhǎng)條形,排列規(guī)則。氣門(mén)極大,圓形。菌絲散在或黏結(jié)成團(tuán),無(wú)色或淡棕色,細(xì)長(zhǎng),稍彎曲(圖3)。3.2rapd基因測(cè)序結(jié)果為地質(zhì)生物標(biāo)記的安全性檢測(cè),首先把抗菌工3.2.1冬蟲(chóng)夏草特異性RAPD標(biāo)記的篩選、克隆與測(cè)序參照文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草RAPD分析中使用的隨機(jī)引物對(duì)冬蟲(chóng)夏草及其常見(jiàn)混淆品進(jìn)行RAPD指紋分析,從中篩選到一個(gè)特異性高、圖譜特征穩(wěn)定的隨機(jī)引物。使用該引物能夠在冬蟲(chóng)夏草中擴(kuò)增出長(zhǎng)約350bp特異性條帶,而在它的混淆品亞香棒蟲(chóng)草、新疆蟲(chóng)草、北蟲(chóng)草(人工培養(yǎng))中沒(méi)有該條帶產(chǎn)生(圖4,條帶4)。對(duì)該條帶進(jìn)行膠回收、克隆與測(cè)序,獲得長(zhǎng)度為365bp的基因序列片段。3.2.2冬蟲(chóng)夏草RAPD-SCAR標(biāo)記的鑒別根據(jù)冬蟲(chóng)夏草特異性RAPD標(biāo)記的序列組成,應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件從序列的兩端分別設(shè)計(jì)了一對(duì)鑒別蟲(chóng)草的專(zhuān)用引物Cordyceps-S和Cordyceps-AS,應(yīng)用這對(duì)引物能夠在冬蟲(chóng)夏草中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為291bp的特異性條帶。筆者把蟲(chóng)草291bp的特異譜帶有叫做“CordySCAR”(Corsequencecharacterizedamplifiedregions,SCAR)。這樣僅通過(guò)PCR反應(yīng)就可將冬蟲(chóng)夏草與混淆品區(qū)分鑒別(圖5)。4本實(shí)驗(yàn)提高了保護(hù)方式的檢測(cè)效率,為了保冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材,具有悠久的藥用歷史,是歷版《中國(guó)藥典》收載的品種之一,2010年版《中國(guó)藥典》僅記載了藥材的性狀鑒別項(xiàng),主觀(guān)性強(qiáng),有時(shí)難以將冬蟲(chóng)夏草與其易混淆品區(qū)分鑒別。本實(shí)驗(yàn)在性狀鑒別的基礎(chǔ)上,對(duì)冬蟲(chóng)夏草橫切面組織與藥材粉末特征進(jìn)行了觀(guān)察描述,并將顯微特征用數(shù)碼成像生動(dòng)形象的體現(xiàn)出來(lái),既保證了鑒別特征的真實(shí)性和客觀(guān)性,同時(shí)也省去了顯微繪圖所帶來(lái)的工作量,縮短了鑒別時(shí)間,提高了冬蟲(chóng)夏草顯微鑒別的效率。關(guān)于冬蟲(chóng)夏草的鑒別研究已有很多文獻(xiàn)報(bào)道,主要都是基于形態(tài)特征觀(guān)察的性狀鑒別［3-6］。陳小秋等［7］對(duì)冬蟲(chóng)夏草的粉末特征進(jìn)行了描述,但是對(duì)粉末中較易觀(guān)察到的“氣門(mén)”沒(méi)有進(jìn)行觀(guān)察描述,本實(shí)驗(yàn)在粉末鑒別中增加了該項(xiàng)特征。另外,目前關(guān)于冬蟲(chóng)夏草組織橫切面組織特征方面的報(bào)道很少,本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)冬蟲(chóng)夏草的子座與蟲(chóng)體部分進(jìn)行了觀(guān)察,并進(jìn)行了特征描述,豐富了冬蟲(chóng)夏草的顯微鑒別依據(jù)。性狀與顯微鑒別是建立在冬蟲(chóng)夏草表型特征觀(guān)察描述水平上的鑒別方法,有時(shí)會(huì)受到蟲(chóng)草生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限或者因加工后形態(tài)發(fā)生變化的影響,在應(yīng)用時(shí)會(huì)有一定的局限性。Feng等［2］從68條RAPD隨機(jī)引物中篩選到4條引物用于區(qū)分鑒別不同產(chǎn)地的冬蟲(chóng)夏草,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這4條引物對(duì)冬蟲(chóng)夏草及其常見(jiàn)混淆品亞香棒蟲(chóng)草、新疆蟲(chóng)草、人工培養(yǎng)的北蟲(chóng)草進(jìn)行了RAPD分析,篩選