中藥冬蟲夏草的鑒別研究

中藥冬蟲夏草的鑒別研究

甘草是麥角菌科的一種真菌甘草。寄生蟲位于蝙蝠科昆蟲蟲的頭部和幼體的干燥部位。它是新的。它具有補(bǔ)充肺、益腎、止血和粘液的功效。治療肺虛、咳嗽、出血和地方志。它是我國著名的預(yù)防疾病之一。冬蟲夏草的生長環(huán)境獨(dú)特,分布區(qū)域有限,僅產(chǎn)于我國西藏、青海、四川西部及甘肅南部地區(qū)海拔3000米以上的高原地帶,生長周期2~3年,目前尚沒有實(shí)現(xiàn)人工栽培。由于有限的野生資源與巨大的市場需求,冬蟲夏草成為我國目前價(jià)格最為昂貴的名貴滋補(bǔ)中藥。資源短缺也導(dǎo)致藥用市場上冬蟲夏草混偽品現(xiàn)象嚴(yán)重,常見混淆品如亞香棒蟲草(C.barnesii)、新疆蟲草(C.grsacilis)、北蟲草(C.militaris)等,因此科學(xué)準(zhǔn)確的進(jìn)行冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別十分迫切而重要。近年來,有關(guān)冬蟲夏草極其混淆品的鑒別研究也有一些報(bào)道［2-7］,但是鑒別方法多局限于傳統(tǒng)的生藥學(xué)鑒別,在應(yīng)用上具有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)在性狀、顯微鑒別的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用DNA分子鑒別技術(shù),在基因水平對冬蟲夏草進(jìn)行鑒別研究,為冬蟲夏草的鑒別提供新的科學(xué)依據(jù)。1ssr-pcr檢測野生冬蟲夏草、亞香棒蟲草、新疆蟲草分別采集于我國西藏、青海、新疆等省區(qū),經(jīng)香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心董婷霞博士鑒定學(xué)名,樣品現(xiàn)存放于香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心。DNeasyPlantMiniKit試劑盒(QIAGEN公司);WizardTMPCRPrepsDNAPurificationSystem(Pro-mega公司);TaqDNA聚合酶(Progema公司);dNTP(Progema公司);DNAMarker(MBIFermentas公司)。Olympus光學(xué)顯微鏡(Olympus公司);PCRSystem9700(PE公司);DU-640核酸蛋白分析儀(BECKMAN公司);蛋白核酸成像儀(PharmaciaBiotech公司)。2方法2.1設(shè)計(jì)臨時(shí)中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)聯(lián)點(diǎn)在性狀鑒別與藥材數(shù)碼成像拍攝的基礎(chǔ)上,采用石蠟制片法分別制作冬蟲夏草子座可孕部位和蟲體橫切面永久制片,采用粉末制片法制作冬蟲夏草粉末臨時(shí)制片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織橫切面特征與藥材粉末特征,數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝主要顯微鑒別特征。2.2rapd片段的純化及純化2.2.1DNA的提取、RAPD分析冬蟲夏草及其混淆品的DNA提取、RAPD分析見文獻(xiàn)報(bào)道的方法。2.2.2特異性RAPD擴(kuò)增片段(RAPD-SCAR)克隆測序?qū)Χx夏草的特異性RAPD擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收純化,純化片段與pGEM-T載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆并進(jìn)行序列分析。2.2.3SCAR-PCR標(biāo)記鑒別引物的設(shè)計(jì)與鑒別條件的建立用Primerpremier5.0軟件從RAPD-SCAR序列的兩端分別設(shè)計(jì)上下游引物。通過對鑒別PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立PCR鑒別反映參數(shù):①94℃預(yù)變性5min;②94℃變性1min;③65℃復(fù)性30s;④72℃延伸45s;⑤重復(fù)②~④步驟共27個(gè)循環(huán);⑥72℃保溫3min。3結(jié)果3.1子座與子囊殼特征3.1.1性狀鑒別冬蟲夏草由蟲體與從蟲頭部長出的真菌子座相連而成。蟲體似蠶,長3~5cm,直徑3~8mm;表面深黃色至黃棕色,有環(huán)紋20~30個(gè),近頭部的環(huán)紋較細(xì);頭部紅棕色,足8對,中部4對較明顯;質(zhì)脆,易折斷,斷面略平坦,淡黃白色,有時(shí)中間有一個(gè)近“V”形或不規(guī)則形狀的灰黑色芯。子座細(xì)長圓柱形,長4~7cm,直徑2.5~3.5mm;表面深棕色至棕褐色,有細(xì)縱皺紋,上部稍膨大;質(zhì)柔韌,斷面類白色。氣微腥,味微苦(圖1)。3.1.2顯微鑒別橫切面特征:子座可孕部位橫切面:近圓形,內(nèi)部充滿了密集的菌絲。子囊殼呈卵圓形或橢圓形,分布于子座表面,子囊殼內(nèi)有多數(shù)線形的子囊,子囊殼間由密集的菌絲相連(圖2)。蟲體橫切面:近圓形或不規(guī)則形,中間有一個(gè)近“V”形或不規(guī)則形狀的芯。外側(cè)為體壁,內(nèi)為大量的菌絲,其間有裂隙。體表著生很多長短不一的剛毛(圖2)。粉末特征:呈棕色,蟲體體壁碎片淺黃色或淺棕黃色,密布瘤狀突起;剛毛極多,長刺狀或短刺狀,有的可見剛毛脫落以后留下的小凹窩。蟲體碎片成片分布,有的與棕色的體壁相連,淡灰色,細(xì)胞界限不明顯,內(nèi)充滿圓形的顆粒物。子座碎片成片分布,有的與棕色的子座表皮相連,充滿密集的菌絲,菌絲淡灰色,細(xì)長條形,排列規(guī)則。氣門極大,圓形。菌絲散在或黏結(jié)成團(tuán),無色或淡棕色,細(xì)長,稍彎曲(圖3)。3.2rapd基因測序結(jié)果為地質(zhì)生物標(biāo)記的安全性檢測,首先把抗菌工3.2.1冬蟲夏草特異性RAPD標(biāo)記的篩選、克隆與測序參照文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)不同產(chǎn)地冬蟲夏草RAPD分析中使用的隨機(jī)引物對冬蟲夏草及其常見混淆品進(jìn)行RAPD指紋分析,從中篩選到一個(gè)特異性高、圖譜特征穩(wěn)定的隨機(jī)引物。使用該引物能夠在冬蟲夏草中擴(kuò)增出長約350bp特異性條帶,而在它的混淆品亞香棒蟲草、新疆蟲草、北蟲草(人工培養(yǎng))中沒有該條帶產(chǎn)生(圖4,條帶4)。對該條帶進(jìn)行膠回收、克隆與測序,獲得長度為365bp的基因序列片段。3.2.2冬蟲夏草RAPD-SCAR標(biāo)記的鑒別根據(jù)冬蟲夏草特異性RAPD標(biāo)記的序列組成,應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件從序列的兩端分別設(shè)計(jì)了一對鑒別蟲草的專用引物Cordyceps-S和Cordyceps-AS,應(yīng)用這對引物能夠在冬蟲夏草中擴(kuò)增出長度為291bp的特異性條帶。筆者把蟲草291bp的特異譜帶有叫做“CordySCAR”(Corsequencecharacterizedamplifiedregions,SCAR)。這樣僅通過PCR反應(yīng)就可將冬蟲夏草與混淆品區(qū)分鑒別(圖5)。4本實(shí)驗(yàn)提高了保護(hù)方式的檢測效率,為了保冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有悠久的藥用歷史,是歷版《中國藥典》收載的品種之一,2010年版《中國藥典》僅記載了藥材的性狀鑒別項(xiàng),主觀性強(qiáng),有時(shí)難以將冬蟲夏草與其易混淆品區(qū)分鑒別。本實(shí)驗(yàn)在性狀鑒別的基礎(chǔ)上,對冬蟲夏草橫切面組織與藥材粉末特征進(jìn)行了觀察描述,并將顯微特征用數(shù)碼成像生動形象的體現(xiàn)出來,既保證了鑒別特征的真實(shí)性和客觀性,同時(shí)也省去了顯微繪圖所帶來的工作量,縮短了鑒別時(shí)間,提高了冬蟲夏草顯微鑒別的效率。關(guān)于冬蟲夏草的鑒別研究已有很多文獻(xiàn)報(bào)道,主要都是基于形態(tài)特征觀察的性狀鑒別［3-6］。陳小秋等［7］對冬蟲夏草的粉末特征進(jìn)行了描述,但是對粉末中較易觀察到的“氣門”沒有進(jìn)行觀察描述,本實(shí)驗(yàn)在粉末鑒別中增加了該項(xiàng)特征。另外,目前關(guān)于冬蟲夏草組織橫切面組織特征方面的報(bào)道很少,本實(shí)驗(yàn)分別對冬蟲夏草的子座與蟲體部分進(jìn)行了觀察,并進(jìn)行了特征描述,豐富了冬蟲夏草的顯微鑒別依據(jù)。性狀與顯微鑒別是建立在冬蟲夏草表型特征觀察描述水平上的鑒別方法,有時(shí)會受到蟲草生長環(huán)境、生長年限或者因加工后形態(tài)發(fā)生變化的影響,在應(yīng)用時(shí)會有一定的局限性。Feng等［2］從68條RAPD隨機(jī)引物中篩選到4條引物用于區(qū)分鑒別不同產(chǎn)地的冬蟲夏草,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這4條引物對冬蟲夏草及其常見混淆品亞香棒蟲草、新疆蟲草、人工培養(yǎng)的北蟲草進(jìn)行了RAPD分析,篩選