生物化學課件

第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由一條(單體蛋白質(zhì))或多條(寡聚蛋白質(zhì))具有確定的氨基酸序列的多肽鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大(NAA=M/110,128-18)單純蛋白質(zhì)（simpleprotein)：僅由氨基酸組成，不含其它化學成分。綴合蛋白質(zhì)(conjugatedprotein)：除含有氨基酸外的各種化學成分作為其結(jié)構(gòu)的一部分。非蛋白質(zhì)部分稱為輔基(prostheticgroup)或配體(ligand)。

單純蛋白質(zhì)（按溶解度分類）清蛋白球蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白組蛋白魚精蛋白硬蛋白

綴合蛋白質(zhì)（按非氨基酸成分分類）糖蛋白脂蛋白核蛋白磷蛋白金屬蛋白血紅素蛋白黃素蛋白單純蛋白質(zhì)分類結(jié)合蛋白質(zhì)分類

蛋白質(zhì)（按生物學功能分類）酶調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運蛋白貯存蛋白收縮和游動蛋白結(jié)構(gòu)蛋白支架蛋白保護和開發(fā)蛋白異常蛋白蛋白質(zhì)的形狀和大小形狀纖維狀球狀膜蛋白蛋白質(zhì)的相對分子量從大約6000～1×106或更大一些。單體蛋白質(zhì)(monomeric

protein)：僅由一條多肽鏈組成。其相對分子量除以110估計氨基酸殘基的數(shù)目。寡聚蛋白質(zhì)(oligomeric

protein)：由兩條或多條多肽鏈組成。每條多肽鏈稱為亞基(subunit)。蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)：多肽鏈的氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)：多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布即構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)：蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎上再進一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)(quarternarystructure)：具有二條或二條以上獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)組織層次：蛋白質(zhì)的構(gòu)象：指蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下所特有的空間結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)組織層次：一級（共價鍵）、二級（氫鍵）、三級（多種非共價鍵）和四級（亞基締合）

四、蛋白質(zhì)功能的多樣性

蛋白質(zhì)的序列異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種特異性的結(jié)構(gòu)基礎。蛋白質(zhì)的生物學功能：1.催化；2.調(diào)節(jié)；3.轉(zhuǎn)運；4.貯存；5.運動；6.結(jié)構(gòu)成分；7.支架作用；8.防御與進攻；9.異常功能；……

蛋白質(zhì)（protein）是生活細胞內(nèi)含量最豐富、功能最復雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學最基本的命題。生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：

一.基本問題---肽一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。（公認的pro組織方式，證據(jù)？）由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽（寡肽？）。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。

在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

1.多肽

肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示肽鍵。

2.肽鍵

肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子(2s2)與羰基具有明顯的共軛作用(共振相互作用)。組成肽鍵的6個原子處于同一平面(肽平面)。肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：

限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)

形成酰胺平面

產(chǎn)生鍵的平均化

大多數(shù)情況下(除Pro)，肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（resonancestructure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由CO-NH構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個原子和它相鄰的兩個α-碳原子多處于同一個平面上。多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成3.肽的物理和化學性質(zhì)：①游離α-NH2：pH活性低，化學性質(zhì)相似(與AA中比較)②游離α-COOH：pH活性低，化學性質(zhì)相似(與AA中比較)③側(cè)鏈R基：pH活性和化學性質(zhì)與AA中相似短肽的晶體是離子品格，在水溶液中以偶極離子存在。在pH0-14范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不能解離。小肽的滴定曲線和氨基酸的滴定曲線很相似。肽的化學反應也和氨基酸一樣，游離的α－氨基、α－羧基和R基可以發(fā)生與氨基酸中相應的基團類似的反反應。雙縮脲反應是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應。一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和，但較長的肽或蛋白質(zhì)的旋光度則不能這樣簡單相加。凈電荷的計算(P166-167)

4.天然存在的重要多肽

在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽(GSH)；蛇毒多肽等。

谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu-Cys-Gly），廣泛存在于生物細胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽

Leu-腦啡肽

二.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)包括：

(1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.(2)多肽鏈的氨基酸順序，

(3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置?！锲渲凶钪匾氖嵌嚯逆湹陌被犴樞?，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。2.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上萬種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。

(1)測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求

A.樣品必需純（>97%以上）；

B.知道蛋白質(zhì)的分子量；(2)測定步驟

①測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目：通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

②多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).

③二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍谟?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

★巰基的保護④

測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽鏈的N-末端和C-末端

★末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有：

A、二硝基氟苯（DNFB）法：N-末端游離氨基①酸水解后，N-末端AA成為黃色DNP-AA衍生物②排除側(cè)鏈DNP衍生物的干擾：用有機溶劑抽提，側(cè)鏈DNP衍生物留在水相B、丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到1

10-9M。N-末端游離氨基的反應，生成PTH-AA衍生物可用有機溶劑抽提、干燥后做鑒定。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。C、異硫氰酸苯酯（PITC）法苯氨基硫甲酰肽噻唑啉酮苯胺苯乙內(nèi)酰硫脲AAD、肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。(n-1)

E、氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。F、羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。⑥多肽鏈斷裂成多個肽段:可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解的方法有：A.酶裂解法胰蛋白酶(trypsin)

這是最常用的蛋白水解酶，專一性強，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。得到的是以Arg或Lys為C-末端殘基的肽段，肽段數(shù)目等于多肽鏈中Arg和Lys總數(shù)加1。為了減少胰蛋白酶的作用位點，可以通過化學修飾將其側(cè)鏈基體保護起來。用馬來酸酐可以保護Lys殘基側(cè)鏈上的ε－NH2，胰蛋白酶就不會水解Lys竣基參與形成的肽鍵，只能斷裂Arg羧基所形成的肽鍵；反之，如果用1，2－環(huán)己二酮修飾Arg的胍基，則胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽鍵。如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點，可以用丫丙啶處理多肽鏈樣品，這時Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似Lys的側(cè)鏈，也具有ε－NH2。這樣胰蛋白酶便能斷裂Cys羧基端的肽鍵。R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它斷裂Phe、Trp和Tyr及其它疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團是堿性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力將減弱。肽鏈水解位點R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胃蛋白酶(pepsin)

它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外與糜蛋白酶不同的是酶作用的最適pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置時，常用胃蛋白酶來水解。R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑。肽鏈水解位點嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）:常用于斷裂較短的多肽鏈。R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Val,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcalprotease)

當裂解在磷酸緩沖液(pH7.8)中進行的，它能在Glu殘基和Asp殘基的羧基側(cè)斷裂肽鍵。如果改用碳酸氫銨緩沖液(pH7.8)或醋酸銨緩沖液(pH4.0)時，則只能斷裂Glu殘基的羧基側(cè)肽鍵。梭菌蛋白酶（clostripain）專門裂解Arg殘基的羧基所形成的肽鍵。即使在6mol/L尿素中20小時內(nèi)仍具活力，這樣對不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解將是很有效的。消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）B、化學法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。溴化氰基锍甲基硫氰酸溴化亞氨內(nèi)酯H2O肽酰⑦

測定每個肽段的氨基酸順序：Edman降解法(PITC)、酶解法、依核苷酸序列的推定法A、目標蛋白(抗原)抗體多核糖體mRNAcDNAaa序列B、Edman降解法由Edman于1950年首先提出，用于N末端分析為α-NH2的與苯異硫氰酸酯（PITC）的反應

Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。苯氨基硫甲酰肽噻唑啉酮苯胺少一個AA殘基的肽苯乙內(nèi)酰硫脲AA

示例(十肽的水解)A法水解得到四個小肽：

A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到四個小肽：

B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val重疊法：Ala-Phe-Gly-Lys－Asn-Tyr-Arg－Tyr-His-Val⑧確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。⑨確定原多肽鏈中二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換)。將所得的肽段利用Brown及Hartlay的對角線電泳技術進行分離（過甲酸處理）。+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段三.蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

1.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(SecondaryStructure)結(jié)構(gòu)是指肽鏈主鏈