疾病診斷新方法-

疾病診斷新方法中國醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學教研室金春蓮DNA為基礎(chǔ)的疾病診斷新方法

飛速進展的原因分子生物學新成就1.人類基因組計劃完成.2.很多疾病基因的定位,克隆,鑒定.3.功能基因組學研究的深入分子病因搞清楚----動態(tài)突變、早現(xiàn)遺傳、非孟德爾遺傳現(xiàn)象等.分子生物學新技術(shù)

DNA、RNA、蛋白檢測新技術(shù)1.DNA重組技術(shù),分子雜交技術(shù).2.PCR技術(shù)----PCR-RFLP,PCR-SSCP,PCR-DGGE.3.DNA自動測序.4.DNA芯片技術(shù).電子計算機的廣泛應(yīng)用

DNA為基礎(chǔ)的診斷領(lǐng)域檢測基因結(jié)構(gòu)（DNA），基因功能表達（RNA、蛋白質(zhì)）判斷是否存在基因缺陷，是分子水平的病因診斷?；颊逥NA診斷性檢測a、不受被檢材料來源的影響b、晚發(fā)性遺傳病的癥狀前診斷成為可能c、分子水平闡明遺傳異質(zhì)性（基因座異質(zhì)性、等位基因異質(zhì)性）應(yīng)用這些特征可進行產(chǎn)前基因診斷一、概述(1)基因檢測必須要有針對目標----特定基因(2)直接檢測特定基因的突變----位點、性質(zhì)(3)基因示蹤----連鎖分析受檢材料的選擇：DNA，RNA或蛋白質(zhì)DNA檢測樣品：

血液---最廣泛采用的成人DNA來源漱口液或頰膜刮片---群體篩查

絨毛膜絨毛活組織---產(chǎn)前診斷羊膜腔穿刺取羊水---產(chǎn)前診斷毛發(fā)，精液---法醫(yī)歸檔的病理學標本---腫瘤研究Guthrie卡片---新生兒篩查及樣品保存取自8個細胞期胚胎的1--2個細胞---植入前診斷RNA優(yōu)于DNA，但更難于獲得與操作

1、目的基因易于獲得組織中表達

2、較大基因未知突變篩查

3、RT-PCR和DNA測序相結(jié)合可檢出DNA水平的突變，而且能可靠地檢測出hn-RNA加工過程的異常剪接。RNA檢測時要注意的一些問題：①避免mRNA的降解②目的基因的表達組織③許多突變導致mRNA不穩(wěn)定，因此雜和個體的RT-PCR產(chǎn)物可能只顯示正常等位基因。

蛋白質(zhì)表達分析---檢測特異蛋白質(zhì)

免疫印跡（Westernblot）

免疫組織化學

免疫熒光技術(shù)蛋白質(zhì)截斷試驗（proteintruncationtest,PTT）一種特異性的檢測方法，用于檢測移碼突變、剪接位點突變或產(chǎn)生提前終止密碼子的無義突變。蛋白質(zhì)功能測定在遺傳檢測中發(fā)揮作用

免疫熒光技術(shù)

利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過化學反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測未知抗原或相應(yīng)配體。二、基因檢測基本原理及常用技術(shù)1.核酸分子雜交雙鏈DNA變性

單鏈復性雜種DNA

加熱,強酸,探針

強堿,變性劑探針----一段與待測DNA或RNA互補的核苷酸序列,作為工作狀態(tài)的探針必須是單鏈.常用探針種類----基因組DNA,cDNA,人工合成的寡核苷酸.探針標記放射性同位素標記法-----缺口平移法,末端標記法,隨機引物標記法.非放射性標記法-----地高辛標記,生物素標記,辣根過氧化物酶標記等.(1)斑點雜交(Dotblottinghybridization)

主要應(yīng)用于基因缺失,和拷貝數(shù)改變

ASO探針----檢測已知點突變.(2)Southern印跡雜交1975年EdwardSouthern建立的檢測DNA技術(shù).基因組DNA限制酶消化凝膠電泳分離變性轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(尼龍膜)固定預雜交探針

雜交洗膜放射自顯影分析雜交片段的大小及密度.能推測:1.DNA片段的缺失,插入,重排等.2.改變限制酶酶切位點的點突變.3.DNA擴增等拷貝數(shù)改變.4.RFLP等多態(tài)性.NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP隨機引物標記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復姓SouthernBlotDNA

樣品

應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測3）基因表達分析

點樣Probe-32P檢測AB1234(3)Northern印跡雜交

檢測RNA的分子雜交技術(shù)提取組織總RNAoligodTmRNA含甲醛

的瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移預雜交探針雜交洗膜放射自顯影

檢測特異mRNA大小和表達量.(4)原位雜交及熒光原位雜交(Flurescenceinsituhybridization,FISH)

染色體標本上,組織切片上分子雜交NortherBlot原位雜交----3H標記探針FISH-----熒光素或生物素標記應(yīng)用于基因定位，染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常診斷。組織切片上的FISH----mRNA水平表達及一些病原體感染診斷。2.PCR技術(shù)（Polymerasechainreaction)1985年美國cetus公司的KaryMullis創(chuàng)建，80年代一向革命性技術(shù)，1993年獲諾貝爾化學獎。模擬生物體內(nèi)的DNA復制，在體外DNA聚合酶酶促合成某一特異DNA片斷的技術(shù)。步驟：

變性

20----30周期復性延伸引物的核苷酸順序?qū)Q定擴增片斷特異性及其長度，該技術(shù)靈敏度高，特異性強，操作簡便，快捷，目前自動化操作。（1）PCR----RFLP（2）PCR----SSCP(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)

(3)PCR----DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis）（4）PCR---DHPLC

PCRPCR擴增三、篩查致病基因突變篩查致病基因的缺陷----點突變、缺失、重復、重排及動態(tài)突變等。受諸多因素的限制，僅限于

遺傳方式已知，

致病基因或cDNA已被克隆分離，致病基因的突變性質(zhì)與疾病關(guān)系已被闡明等前提下。未知點突變檢測缺失（重復）檢測PCR----SSCP

1、多重PCRPCR----DGGE2、MAPHPCR----DHPLC3、MLPA4.Sequencing5.DNA芯片技術(shù)

（1）PCR-SSCP原理：PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率。相同長度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，可產(chǎn)生不同的構(gòu)象，造成泳動變位。能檢測已知和未知的堿基置換。長度相同，但只要一個堿基的差別→形成不同構(gòu)象→泳動速率不同→形成不同泳動帶PCR-SSCP過程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入

PCR擴增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

PCR-SSCP過程

關(guān)鍵是電泳條件----凝膠的溫度,離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等相關(guān).該方法靈敏度高,但存在假陰性,檢出率約有80%.（3）PCR-DGGE原理：利用DNA片段的溶解性質(zhì)，使同源和異源雙鏈分離的電泳系統(tǒng)。PCR擴增后的DNA片段在變性梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，使正常和突變的同源和異源雙鏈DNA產(chǎn)生泳動變位，使其分離。能檢測未知的堿基置換。垂直DGGE結(jié)果

圖3確定變性劑濃度范圍20%-80%6%DGGE檢測家系成員PAH基因外顯子6的電泳圖：Ⅱ1Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ2

ⅠⅡ121N？(3)PCR-DHPLC也稱WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)。原理：利用高效液相色譜原理，通過一個DNA分離柱----DNASep柱進行核苷酸片段的分離和分析。DNASep柱分離：

①在非變性條件下（50oC）DNA雙鏈按長度分離。

②部分變性條件下（95oC變性后逐漸冷卻到一定溫度）雜合雙鏈和純合雙鏈（有突變時）能分離。③完全變性條件下，DNA雙鏈解開，二級結(jié)構(gòu)消失，DNA或RNA單鏈按堿基順序分離。DNA部分變性條件下檢測DNA變異的原理：

變異型和野生型DNA可形成同源和異源雙鏈．其在色譜柱上保留時間存在差異，異源雙鏈因存在錯配區(qū)而更易變性，在色譜柱保留時間短于同源雙鏈而先被洗脫下來，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，據(jù)此可以分辨出變異型DNA.在經(jīng)歷95℃變性再緩慢復性后,存在多態(tài)或突變位點的靶序列PCR產(chǎn)物會雜交形成雜合雙鏈(heteroduplex)和純合雙鏈(homoduplex)混合物

DHPLC的特點：靈敏，準確；分析速度快，單個樣本的分析時間僅需幾分鐘；容易實現(xiàn)自動化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩查檢測變異的PCR產(chǎn)物長度范圍最好在200～500bpDHPLC可應(yīng)用于：①DNA片段已知和未知點突變的檢測及突變篩查。②RFLP，STRs，SNP等多態(tài)的研究及基因型分析。③甲基化分析。④基因表達的定量及基因表達差異分析。⑤寡核苷酸的分析及純化。（4）DNA測序Sanger法-----雙脫氧核苷酸末端終止法。P-OH2C不能形成5’磷酸和

5’堿基3’OH之間的磷酸

4’1’二脂鍵（因3’也脫

3’2’氧）而終止反應(yīng)。

HH4個反應(yīng)體系分別加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，將產(chǎn)生不同長度（在A，G，C，T處隨機終止）的DNA片段，分別在變性凝膠電泳分離呈梯狀帶型，自下而上是5’3’被合成的DNA鏈順序。DNA自動測序應(yīng)用如上原理，不同的是①4種不同熒光染料標記的dNTP摻入酶促反應(yīng)(不用分4個反應(yīng)體系).②經(jīng)過毛細管凝膠電泳分離(不用分4個泳道).③激光分析和計算機處理,直接標出堿基序列.（5）DNA芯片技術(shù)在雜交和測序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的.①.大規(guī)模集成電路手段把成千上萬個寡核苷酸探針有規(guī)律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核苷酸陣列.②.將待測的DNA,RNA或cDNA用熒光標記后在DNA芯片上與探針雜交.③.用激光共聚焦顯微鏡對芯片進行掃描,配合計算機處理熒光信號,得出所需信息.

基因芯片如：

靶基因

基因組

特異性片段探

針

----AGCTTAGC----靶序列

----TCGAATCG----probe

ABC

12345檢測檢測缺失和重復⑴多重PCR（multiplexPCR）一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增出多個特異的PCR產(chǎn)物。常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失突變，或作為PCR擴增內(nèi)對照。

⑵多重可擴增探針雜交(MAPH)

MAPH(multiplexamplifiablprobehybridization)

是近年來發(fā)展起來的一種用于基因組中DNA拷貝數(shù)檢測的新技術(shù)。

該方法根據(jù)所檢測的DNA序列,制備若干具有通用引物的PCR產(chǎn)物作為可擴增探針組,與固定在尼龍膜上待測的基因組DNA雜交。用磁珠回收特異性雜交的探針,通用引物擴增后,凝膠電泳分析。多重可擴增探針雜交(multiplexamplifiablprobehybridization,MAPH)的原理

(3)多重連接探針擴增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)的原理MLPA是基于MAPH技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種靈敏度很高的相對定量技術(shù)，利用簡單的雜和（hybridization）、連接（ligation）及PCR擴增（PCRamplication）反應(yīng)，在單一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測最多40個不同片斷的拷貝數(shù)的變化。MLPA的原理

MLPA和MAPH技術(shù)的應(yīng)用:

遺傳疾病基因缺失、重復(如SMA、DMD基因等)、基因甲基化檢測(如Prader-Willisyndrome(PWS)andAngelmansyndrome(AS))、抑癌基因診斷(如Breastcancer、Lungcancer…等)及mRNA分析等。如染色體數(shù)目異常(Trisomy13、18&21)、

至今已發(fā)展出的檢測探針種類，已超過上百種。

141為正常對照，881患兒外顯子2重復134患兒外顯子51，52，53，54缺失，135為患者母親，為外顯子51，52，53，54缺失攜帶者，137為正常女性對照，140為正常男性對照。四、檢測特定序列變化----已知突變檢測適用于：a檢測特定基因中常出現(xiàn)的突變

b檢測家系內(nèi)已確定的突變已知點突變檢測

技術(shù)

1.限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析法.2.ASO探針雜交法.3.等位特異性PCR.4.PCR-SSCP.PCR-DGGE

、PCR-DHPLC5.Sequencing

DNA芯片技術(shù)

(1)限制性酶切圖譜分析法---檢測已知突變基因較大片段缺失或插入酶切片段長度改變.基因點突變正好發(fā)生在某限制酶識別位點酶切點消失或增加酶切片段長度改變.例1.β地貧-----β珠蛋白部分缺失缺第2內(nèi)含子部分和第3外顯子以及3’端非翻譯序列的部分缺失.

A(正常)pstIpstI4.4kbE1I1E2I2E35’3’

B(?O—地貧)5’3’3.7kbpstIpstI

AB4.4kb3.7kbGenomicDNApstI

消化電泳分離southern轉(zhuǎn)移以?珠蛋白為探針檢測結(jié)果

A(正常)-----4.4kb雜交帶

B(異常)------3.7kb雜交帶(缺失0.7kb)例2HbSβ鏈第6位AAGATGTT(AT)(Glu)(Vol)

結(jié)果MstI切點消失正常

5’3’MstI

βAβAβS1.15KbβS

1.35kb1.35kb1.15kb

GenomicDNA經(jīng)MstI酶解后

β珠蛋白基因為探針Southern印跡雜交結(jié)果

:βAβA----1.15kb,0.2kb

βAβS----1.35kb,1.15kb,0.2kb

βSβS----1.35kb酶切圖譜法檢測的缺點:①.不直接影響酶切點的突變不能檢測到.②.產(chǎn)生的片段大小太相似也不易被檢測到.目前還可以特異性擴增含酶切位點的PCR擴增片段,再經(jīng)酶切后電泳檢測----更簡便,快速,也能彌補缺點2.(2)ASO探針雜交法---檢測已知點突變ASO探針(allelespecificoligonucleotideprobe,等位特異性寡核苷酸探針)以點突變?yōu)橹行暮铣?0bp左右的一對探針與正常序列雜交與異常序列雜交的一對探針例如:α—抗胰蛋白酶缺乏癥

ASO探針

正常:5’ACCATCGACGAGAAAGGGA3’異常:5’ACCATCGACAAGAAAGGGA3’斑點雜交結(jié)果:NNNAAA

ab優(yōu)點:

1.這種探針可準確合成.2.擺脫了對限制酶的依賴性,即不改變酶切位點的突變也能檢測.

缺點:

突變位點及性質(zhì)清楚的前提下才能合成ASO探針,只能檢測已知點突變.(3)等位基因特異性PCR擴增

進行配對PCR反應(yīng)，一個引物在兩個反應(yīng)體系中相同（通用引物），另一個引物在兩個反應(yīng)體系中稍有不同。一個是正常序列特異引物，另一個是突變序列特異引物（即引物3’末端最后一個堿基不同）。（4）三核苷酸重復疾病的遺傳檢測Hantington病、強直性肌營養(yǎng)不良、脆性X染色體等三核苷酸重復擴展引起的疾病要應(yīng)用PCR擴增和Southern分子雜交相結(jié)合的方法。五、基因示蹤前提條件：a明確的臨床診斷

b致病基因已被定位

c有可選擇的遺傳標記所謂基因示蹤是以DNA多態(tài)為遺傳標記，進行連鎖分析，判斷是否得到了帶有缺陷基因的染色體而做出診斷。DNA多態(tài)的概念及類型DNA多態(tài)性(DNApolymorphism):

群體當中不同染色體上的基因每幾百個bp中大約有1個的比例存在堿基取代,但對表現(xiàn)型無改變,這種變異的頻率在群體中占1%以上,這種現(xiàn)象叫DNA多態(tài)性,這種變異以孟德爾共顯性遺傳方式傳遞。1.RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)第一代遺傳標記.

由于DNA多態(tài)性,取代的堿基正好位于某一限制酶切割識別順序,那么不同個體,不同染色體上的DNA用相同酶切割時產(chǎn)生不同長度的DNA片段,這種現(xiàn)象叫RFLP.等位片段數(shù)一般是2—3個,即有酶切點和無酶切點.2.VNTR(Variablenumbertandemrepeat,數(shù)目可變的串聯(lián)重復)----第二代遺傳標記.大約幾十bp長的堿基順序在人群中不同染色體上其重復的拷貝數(shù)不同所產(chǎn)生的多態(tài),一般在非編碼領(lǐng)域中.

小衛(wèi)星DNA(6---20bp)n

微衛(wèi)星DNA(2---6bp)n也稱STR(smalltandemrepeat)例如:FⅧgeneST14(DXS52)位點,存在(60bp)n的VNTR.

DMDgeneintron44,45,49,50中存在(CA)n多態(tài).PAHgeneintron3中STR(4bp)n.優(yōu)點:群體中等位基因數(shù)目多,雜合子率高---更有意義（可提供信息量高）.PCR-VNTR檢測PCR-VNTR3.SNPs(singlenucleotidepolymorphism,單核苷酸多態(tài))---第三代遺傳標記.基因組中廣泛存在的堿基置換,大約幾百---1kb之中有一個的比例.連鎖分析舉例PAHgeneMspI/RFLP23kb19kbMspIMspI19kb23kb基因示蹤的優(yōu)點:不一定清楚病因基因的分子基礎(chǔ),只要有基因內(nèi)或近旁DNA多態(tài)標記就可以分析.缺點:1.必須要有先證者以及家系中相關(guān)各成員的DNA才能分析.2.攜帶者是多態(tài)位點的雜合子時才能分析.3.連鎖分析要充分認識到由于減數(shù)分裂時同源染色體交叉互換導致誤診的可能性.六、基因檢測的應(yīng)用（1）遺傳病-----產(chǎn)前基因診斷.

1）假肥大性肌營養(yǎng)不良癥是一種嚴重的神經(jīng)肌肉疾病分為DMD

(Duchennemusculardystrophy杜氏肌營養(yǎng)不良癥）

和BMD(Beckermusculardystrophy)，肌萎縮當中占60%.均是由于dystrophin基因突變所致的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病，發(fā)病率為1/3500,XR遺傳.BMD比DMD發(fā)病晚,病情輕.

主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽性.進行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.生化檢測:血清中磷酸肌酸激酶(CPK)升高.乳酸脫氫酶升高（LDH）,肌紅蛋白（Mb）升高。肌電圖:肌源性改變等.1987年Kunkel等定位克隆DMD基因,定位于Xp21,全長2400kb,含79個外顯子,cDNA長度為14kb.目前研究已知DMD的55%---65%是由于DMD基因不同區(qū)段的缺失,缺失發(fā)生熱點區(qū)DMD基因5’端外顯子(2----19)

外顯子44---52區(qū)域，基因重復占5%～10%,點突變占25%左右。其中基因缺失為主要突變類型。

Dystrophin基因及蛋白

直接檢測基因突變:檢測DMD基因缺失（重復）突變

①應(yīng)用多重PCR(multiplexPCR)檢測缺失,18對引物(9*2)-----98%缺失能檢測到.

②多重連接探針擴增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)

檢測DMD基因點突變

應(yīng)用

PCR----DHPLCPCR----SSCPPCR----DGGESequencing等技術(shù)多重PCR檢測缺失Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良(DMD/BMD)方法:根據(jù)dystrophin基因缺失的分布設(shè)計12對引物,分成3組第1組:為外顯子19、43、45、34引物第2組：為外顯子51、12、50、53引物第3組：為外顯子48、17、8、52引物分別對患者基因組DNA進行擴增，每次擴增均同時設(shè)正常對照。1:DL2000marker;2:正常對照(第1組引物);3.4:檢出外顯子19的先證者和胎兒:5:正常對照(第2組引物);6.7:檢出外顯子51的先證者和胎兒;8:正常對照(第3組引物);9.10:檢出外顯子48的先證者和胎兒.134患兒外顯子51，52，53，54缺失，135為患者母親，為外顯子51，52，53，54缺失攜帶者，137為正常女性對照，140為正常男性對照。多重連接探針擴增(MLPA)檢測Dystrophin基因第47外顯子DHPLC檢測結(jié)果左側(cè)為無關(guān)個體第47外顯子的正常峰形右側(cè)為DMD患者13號樣本第47外顯子的突變峰形。

基因示蹤---連鎖分析

RFLP連鎖分析