利用發(fā)酵罐培養(yǎng)小球藻高密度異養(yǎng)培養(yǎng)研究

利用發(fā)酵罐培養(yǎng)小球藻高密度異養(yǎng)培養(yǎng)研究

小球藻是一個普生細胞綠色藻類，屬于綠色藻類芽囊藻類（cherol）。小球藻廣泛分布于自然界,易于培養(yǎng),不僅能利用光能自養(yǎng),還能在異養(yǎng)條件下利用有機碳源進行生長、繁殖;并且生長繁殖速度快,是地球上動植物中唯一能在20h增長4倍的生物,所以其應(yīng)用價值很高。小球藻富含蛋白質(zhì)、多種色素、B族維生素、必需氨基酸、微量元素和一些生物活性代謝產(chǎn)物,而且同時具有抗癌、抗輻射、抗感染、抗氧化、防治高血脂癥、防治便秘以及骨髓抑制等一系列生理保健功能,是目前保健食品開發(fā)應(yīng)用最理想和研究最多的微藻之一。在我國,60年代曾有養(yǎng)殖小球藻的歷史,但由于當(dāng)時對小球藻的保健和藥理作用沒有闡明等原因,并沒有形成產(chǎn)業(yè)化。近年來,我國開始重視對小球藻的開發(fā)利用,其作為食品領(lǐng)域的一個重要分支具有廣闊的發(fā)展前景。小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)是指用一種或多種有機物作為能源和碳源,CO2可有可無,在黑暗中生長。以異養(yǎng)方式培養(yǎng)小球藻是對微藻光合自養(yǎng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的革新。這種培養(yǎng)方式避免了光自養(yǎng)培養(yǎng)過程中光抑制或光限制等問題,降低了能耗,節(jié)約了成本,為工業(yè)化大規(guī)模高密度培養(yǎng)微藻奠定了基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)小球藻的高密度培養(yǎng),培養(yǎng)小球藻也可以采用微生物發(fā)酵中使用的培養(yǎng)方式,主要有批式培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和以批式培養(yǎng)作為基礎(chǔ)的流加培養(yǎng)等。文章中,選用本實驗室中批量實驗已經(jīng)確定的培養(yǎng)基的配置比例、溫度、接種量,通過對不同發(fā)酵工藝及其條件的優(yōu)化和研究不同取料量比時小球藻的生長穩(wěn)定情況,確定適宜的發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)條件,獲得穩(wěn)定連續(xù)取料參數(shù)。1材料和方法1.1藻類藻類小球藻Y4,購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。1.2在實驗室開始時，確定了培養(yǎng)基和培訓(xùn)條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基:BG11液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度:29℃;接種量為20%。1.3實驗方法和設(shè)計1.3.1培養(yǎng)溫度的確定接種前,培養(yǎng)基和1L發(fā)酵罐容器于121℃加溫加壓滅菌20min,在無菌操作臺上按接種量20%加入新鮮藻液,安裝好裝置后,設(shè)定培養(yǎng)溫度為29℃。1.3.2補料時間將藻株Y4在發(fā)酵過程中,按照以下方式補料:自接種開始,第24h補料60mL,第48小時補料100mL,第72小時補料50mL,以后每隔24h補料50mL,至不再增長。從pH、DO(溶氧量)兩方面對小球藻培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。1.3.3含微藻細胞的培養(yǎng)以半連續(xù)培養(yǎng)(從培養(yǎng)系統(tǒng)達到對數(shù)生長期末期開始,定期收獲一定比例的含微藻細胞的培養(yǎng)液,同時添加補充不含微藻細胞的新鮮培養(yǎng)基)方式對藻株Y4進行培養(yǎng),對小球藻的取料量、最佳C/N、流加液適宜碳濃度三個條件進行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下,確定最佳取料量以使藻株生長穩(wěn)定。1.3.4藻細胞處理以生長量表示細胞生長量。其測定方法為:用移液槍取均勻小球藻液4mL,放入5mL離心管,8000r/min下離心10min,除去上清液,用蒸餾水洗滌藻細胞,重復(fù)離心、洗滌3次后,55℃烘干至恒重。1.3.5超聲輔助萃取法實驗采用超聲波提取法:藻液離心后冷凍干燥成為粗藻粉,將粗藻粉研磨破壁后制成實驗中提油脂所需藻粉。稱取此藻粉0.1g于5mL離心管中。加入1.5mL正己烷和1.5mL異丙醇,搖勻后放入超聲儀中30℃超聲輔助萃取25min,萃取后于8000r/min離心10min,移取上層清液于10mL離心管中。重復(fù)上述步驟兩次。將10mL離心管放入105℃烘箱加熱蒸發(fā)2h,油脂含量按下式計算:2結(jié)果與分析2.1提高微藻產(chǎn)量為了提高小球藻產(chǎn)量,使用1L發(fā)酵罐采用補料流加培養(yǎng)形式對小球藻進行培養(yǎng)。流加培養(yǎng)能夠消除底物的抑制,延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間,降低染菌和避免遺傳不穩(wěn)定性,因此可獲得比較高的微藻產(chǎn)量。鹽藻流加培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示,采用流加培養(yǎng)可使氮、磷的濃度維持在較低的起始濃度,從而大大縮短藻體生長的延遲期,同時,不斷供給營養(yǎng)物,調(diào)節(jié)了培養(yǎng)過程中底物的濃度,使鹽藻長時間處于對數(shù)生長期,以較快的速度增殖。2.1.1生長曲線測定采用流加培養(yǎng)方式,研究不同pH對小球藻生長量的影響。選定pH分別為5、6、7、8、9,DO控制為20%,在異養(yǎng)培養(yǎng)方法下培養(yǎng)8d,每天定時取樣進行生長量的測定,生長曲線如圖1所示。由圖1可以看出,藻株在五種pH條件下都能生長,在pH=7時生長量達到最大。當(dāng)pH低于6及高于8時不適宜小球藻生長,生長量有明顯的下降,分析原因為pH影響細胞中酶的活性,過高或過低都會影響細胞的生長。因此,pH為7~8為小球藻的適宜生長條件,本文中接下來的實驗選pH=7進行。2.1.2影響小球藻生長的因素溶解氧(DO)是影響細胞生長的重要因素,采用流加培養(yǎng)方式,確定小球藻利用發(fā)酵罐進行異養(yǎng)培養(yǎng)時最佳DO范圍。使用發(fā)酵罐進行流加實驗,可通過空氣泵通氣直接控制溶液中氧的含量,調(diào)整溶液中DO含量分別為5%、10%、20%、30%、40%,pH調(diào)節(jié)為7,培養(yǎng)8d,觀察小球藻的生長狀況。實驗結(jié)果如圖2。由圖2可以看出,DO值在20%~40%時小球藻生長量較高且相差不大。低于20%時生長量明顯減少。DO低于20%不足以維持小球藻生長,而達到20%后再增加通氣量則對小球藻的生長影響不大。因此DO值在20%~40%范圍內(nèi)較適宜小球藻生長。以下實驗選擇DO值為20%進行。2.2連續(xù)培養(yǎng)方式培養(yǎng)為了達到小球藻的穩(wěn)定生長,采用半連續(xù)培養(yǎng)方式進行異養(yǎng)培養(yǎng)。Otero等在采用半連續(xù)培養(yǎng)方式培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)EPA時發(fā)現(xiàn),增加更新率,脂肪酸的不飽和度隨之增加。而當(dāng)更新率持續(xù)增加至培養(yǎng)基達到氮飽和的狀態(tài),小球藻細胞內(nèi)EPA含量處于一個穩(wěn)定的水平不再增加。因此,確定最優(yōu)條件下的穩(wěn)定連續(xù)補料參數(shù),可維持藻株生長量在穩(wěn)定水平。2.2.1小球藻的生長半連續(xù)培養(yǎng)不同于流加培養(yǎng),除了定期補料外需定期取料。為了確定取料量,本實驗參考活性污泥法中SRT的理論,通過小球藻對數(shù)生長期時間及培養(yǎng)液總量計算小球藻的取料量。小球藻的半連續(xù)培養(yǎng)在實驗室1L發(fā)酵罐中進行,故培養(yǎng)液總量為1L。對數(shù)生長期時間可以通過小球藻的生長曲線觀察獲得,以不同pH對小球藻發(fā)酵罐流加培養(yǎng)的影響圖(圖1)為例,小球藻在3~4d左右達到對數(shù)生長期,3天時生長最快,因此可從72小時處進行取料補料。由于發(fā)酵罐體積較小,1/3的取料量小球藻生長速度達不到維持原培養(yǎng)液的藻細胞密度,造成營養(yǎng)物質(zhì)浪費,故將取料量定為1/4(250mL)。即半連續(xù)培養(yǎng)按照流加培養(yǎng)的初始培養(yǎng)條件,從72h開始,每天取料250mL,補充新鮮培養(yǎng)液250mL。2.2.2初始培養(yǎng)基c/n對小球藻油調(diào)濕的影響為了提高小球藻的生長量和油脂含量,需確定供其生長的最佳C/N。研究發(fā)現(xiàn),氮缺乏可以促進脂肪酸的積累,Shifrin等的研究表明,在氮缺乏條件下,大部分綠藻的脂類含量提高13%~32%。但低氮濃度會對微藻生長產(chǎn)生抑制作用,所以在微藻培養(yǎng)的開始階段,必須供應(yīng)充足的氮源,使其達到較高的生物量,在其達到指數(shù)生長期后,減少氮源以促進脂類積累。本實驗在初始培養(yǎng)基C/N=25到不加氮源即C/N=∞之間設(shè)計五個不同梯度:C/N=25、50、75、100、∞。測定不同C/N時藻株的生長量和使用不同C/N補料液補料油脂含量的變化,測定結(jié)果如圖3和圖4。由圖3,在小球藻生長72h開始取料補料,可能由于小球藻生長速度相對取料量較低,導(dǎo)致生長量有所下降。由于初始培養(yǎng)基C/N=25,故補料中C/N=25的發(fā)酵罐小球藻隨著時間的推移粗脂含量不變。其他發(fā)酵罐中小球藻隨著氮源減少,粗脂含量均有所增加,由圖4可得C/N=100時,粗脂含量達到最高。故補料C/N比選擇為100。2.2.3碳源濃度對小球藻生長量的影響通過批量培養(yǎng),我們獲得小球藻最適培養(yǎng)碳源濃度為50g/L,但在流加培養(yǎng)補料過程中,由于不斷補充新鮮料液,培養(yǎng)液中碳源并不能全部利用,造成營養(yǎng)物質(zhì)浪費,因此需要選擇合適的補料碳源濃度。由于C/N一致的情況下粗脂含量相差不大,故本周期以生長量為指標(biāo),在上周期結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計五個不同梯度選擇最合適碳源濃度。碳源濃度分別設(shè)為10、20、30、40、50g/L。表1為培養(yǎng)結(jié)束后小球藻的生長量,從表中可以看出,碳源濃度為30~50g/L時,生長量相差不大,均大于10g/L?？紤]到經(jīng)濟因素,選擇30g/L作為最適補料碳源濃度。2.3最佳取料量的確定由2.2.1經(jīng)理論分析確定的取料量為1/4,但通過圖3可以看出,取料量為1/4時小球藻的生長量均有所降低。因此,為了維持小球藻的穩(wěn)定生長,設(shè)計實驗,調(diào)整半連續(xù)培養(yǎng)時取料量,確定能夠維持小球藻生長穩(wěn)定的最佳取料量。具體操作流程和實驗結(jié)果如表2和表3。根據(jù)表3結(jié)果,對實驗中小球藻Y4的生長量和比生長速率作圖。由表3、圖5和圖6可知,在未補料階段的72h內(nèi),小球藻成對數(shù)生長,且比生長率較大。在72~144h開始以1/6的比例開始補料后,生長量繼續(xù)增加,但比生長率明顯降低,且一直呈下降趨勢。因此在144h增大補料比例為1/5。144~216h內(nèi),小球藻的生長量和比生長率都基本保持不變?？傻镁S持小球藻生長穩(wěn)定的最佳取料量為1/5。將培養(yǎng)后的小球藻收貨提取油脂,油脂含量為61.3%,說明取料量為1/5時既能維持小球藻的穩(wěn)定生長,又不影響藻株油脂的含量。3小球藻的半連續(xù)培養(yǎng)(1)利用發(fā)酵罐采用流加培養(yǎng)方式異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻Y4,設(shè)計單因素實驗,得到小球藻最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH=7,DO=20%。(2)在流加培養(yǎng)的基礎(chǔ)上改用半連續(xù)培養(yǎng)方式,選定取料量為1/4,優(yōu)化培養(yǎng)條件,得到小球藻半連續(xù)培養(yǎng)時補料最佳C/N為100,補料適宜碳濃度