基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)

目的基因與運(yùn)載體結(jié)合基因工程基本操作過(guò)程基因工程（geneticengineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。基因工程要素：包括外源DNA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等1.提取目的基因2.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)切、接、轉(zhuǎn)、增、檢重組DNA技術(shù)的操作步驟：

外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用.

基因重組:就是利用限制性內(nèi)切酶及其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因．將兩者連接起來(lái)，將目的基因插入于可以自我復(fù)制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增或正確表達(dá)。依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮下列2個(gè)方面。如果研究目的是：(1)表達(dá)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，要考慮選用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對(duì)表達(dá)融合蛋白至關(guān)重要。(2)對(duì)某一基因的上游序列進(jìn)行調(diào)控機(jī)能分析，則需考慮選擇適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因，并將可能具有調(diào)控機(jī)能的目的基因置于報(bào)告基因的上游適當(dāng)位置。若調(diào)控基因可能有增強(qiáng)子作用，還應(yīng)在報(bào)告基因下游適當(dāng)部位插入一個(gè)功能基因，由此反映增強(qiáng)子的作用。一、連接前的準(zhǔn)備為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進(jìn)行適當(dāng)處理，使其可以互相連接，形成新的重組分子。二、連接前的處理載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可用于重組切割，理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下列幾個(gè)條件:1）位于載體上特定的酶切位點(diǎn)要盡可能少,最好是單一酶切位點(diǎn),這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合.2）

在酶切位點(diǎn)之前要有一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子，使插入的目的基因可在該啟動(dòng)子的指導(dǎo)下高效表達(dá)。3）選擇的載體必須在連接后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中的編碼區(qū)讀框不改變。1.對(duì)載體的要求當(dāng)載體和外源DNA用同樣的限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價(jià)地連接起來(lái)，形成重組體分子。但是,當(dāng)靶片段的末端與載體不匹配時(shí)，必須轉(zhuǎn)換其中一個(gè)或兩個(gè)片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換：①

3’凹端補(bǔ)平：使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3’凹端，將不匹配的3‘凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補(bǔ)平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。

②3’突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強(qiáng)烈的3’-5’外切核酸酶活性，可將3’突端切除。

③平端加上人工合成接頭：合成接頭是自相互補(bǔ)的兩個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個(gè)寡聚體可形成帶一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，可有下述不同的連接方法：①粘性末端連接法

②平端連接法③同聚物加尾連接法④人工接頭連接法三．基因與載體的連接4種方法1.同一限制酶切位點(diǎn)連接:由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接.在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子.

上述方法的缺點(diǎn)：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。解決方法：用細(xì)菌的堿性磷酸酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段的連接

2.不同限制酶切位點(diǎn)連接:由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類型的粘性末端，彼此稱為互補(bǔ)末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過(guò)兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補(bǔ)平）。雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。載體與外源DNA結(jié)合處的限制酶切位點(diǎn)仍然保留，可以隨時(shí)從重組載體中通過(guò)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后分離獲得目的基因。不會(huì)自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA的片段沒(méi)有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性內(nèi)切酶切割的平端間的連接。平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端

（二）平端連接提高平頭末端連接效率的方法包括：

①加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)；③加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用；④加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl）。

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，解決方法：

⑴人工接頭連接法：通過(guò)依次加入、連接合成DNA接頭，再用限制酶切加以解決。

⑵同聚物加尾連接法：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3’端加上相互補(bǔ)的同聚尾加以解決。⑶PCR法：通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)擴(kuò)增外源DNA片段，從而加上合適的限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別序列，再用限制酶切加以解決。同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3′端各加上一段寡聚核