葉甲科植物酯酶同工酶的研究

葉甲科植物酯酶同工酶的研究

自20世紀(jì)70年代以來，生物化學(xué)研究的手段逐漸傳播到幾個(gè)學(xué)術(shù)領(lǐng)域，尤其是工作酶的研究，成為物種分化、物種鑒定和系統(tǒng)分類的重要手段（黃原等，1990；李少文等，1987；彭統(tǒng)序，1986）。酯酶同工酶(esteraseisozyme)是能水解酯鍵的一組酶,在生物體內(nèi)廣泛存在。許多實(shí)驗(yàn)證明:它在種系的鑒定中具有很重要的參考價(jià)值(郭曉霞等,2000)。通過物種同工酶的研究,可以由生化特征推測(cè)物種在基因水平的差異,進(jìn)而推測(cè)其血緣關(guān)系和進(jìn)化地位,并推測(cè)它們的系統(tǒng)分類。葉甲科屬鞘翅目葉甲總科,是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲,本文用聚丙烯酰胺垂直凝膠電泳對(duì)葉甲科3亞科13種葉甲的酯酶同工酶進(jìn)行了比較研究,探討以酯酶同工酶來研究葉甲科與亞科的系統(tǒng)分類,與形態(tài)學(xué)確定的系統(tǒng)分類之間的差異,及其在葉甲科系統(tǒng)分類研究中應(yīng)用的可行性(聶傳朋等,2005;胡紅英等,2006)。1材料和方法1.1來自來源1.2酶源及電泳檢測(cè)將野外采集的葉甲置于預(yù)冷的研缽中,加適量提取液(20%蔗糖)及少量石英砂,樣品研磨完后,6000r/min離心10min,貯于4℃下待用。點(diǎn)樣時(shí)吸取上清液作為酶源。采用DYCZ-24D型雙垂直板電泳槽和ECP3000型三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)。分離膠濃度7.5%,pH為8;濃縮膠濃度3%,pH為6.7;電極緩沖液為Tris-Gly,pH為8.3;膠板大小為125mm×100mm×1.5mm。在4℃冰箱中電泳5h(濃縮膠為110V,分離膠為180V)。酶活性染色參照胡能書(胡能書,1985)的方法。膠板經(jīng)染色固定后,測(cè)定各條酶帶的相對(duì)遷移率(relativemobility)。1.3多次電泳時(shí)的移動(dòng)距離各酶帶的相對(duì)遷移率(Rm)是以指示劑溴酚蘭在每次電泳時(shí)的移動(dòng)距離(Xf)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算的。若每一條酶帶從負(fù)極向正極移動(dòng)的距離為Xi,則該酶帶的相對(duì)遷移率:Rm=Xi/Xf。1.4基于類間平均法的聚類分析本文采用系統(tǒng)聚類法,首先將每個(gè)樣本看成一類,計(jì)算它們之間的相似系數(shù)和相異性系數(shù)。本文采用歐氏距離系數(shù)(Euclideandistance),運(yùn)用類間平均法進(jìn)行聚類分析。具體方法是選擇最為相近的兩個(gè)樣本歸為一新類,然后計(jì)算新類與其它樣本之間的相似性,再選擇最相似的兩個(gè)樣本歸為一類,直到所有樣本都?xì)w類為止。系統(tǒng)聚類的具體方法很多,其差異在于類與類之間采用何種相似(或相異)系數(shù)以及如何進(jìn)行并類(白義等,2006)。2結(jié)果和分析2.1實(shí)驗(yàn)菌株的篩選聶傳朋證明葉甲科昆蟲其酯酶同工酶的性別差異小于種間差異(聶傳朋,2004),所以本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)中只是選用采集的標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),未作性別的鑒別。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,共6塊膠板,重復(fù)性比較好。選取比較好的膠板可以看出酶譜分成4個(gè)泳動(dòng)區(qū),即第1～4條帶泳動(dòng)區(qū)、第5～8條帶泳動(dòng)區(qū)、第9～13條帶泳動(dòng)區(qū)以及第14～17條帶泳動(dòng)區(qū)。相應(yīng)地可以推測(cè)葉甲科昆蟲酯酶同工酶可能由4個(gè)基因位點(diǎn)控制,每個(gè)基因位點(diǎn)可能由3～5個(gè)等位基因控制。2.2形態(tài)特征分類從表2可以看出,所有樣品都具有Rm為0.84的帶,可能這條帶代表此科的特點(diǎn)。依形態(tài)特征進(jìn)行分類,以上13種葉甲包括3個(gè)亞科,從表3可以看出,它們的相似性也比較高,并且各亞科均有代表性的酶帶,葉甲亞科具有0.51、0.57等條帶,跳甲亞科具有0.12、0.24、0.45等條帶,螢葉甲亞科具有0.09、0.87兩條帶。2.3葉甲屬類昆蟲聚類分析結(jié)果本文根據(jù)區(qū)帶之間同源性,將測(cè)得的各種酶帶的遷移率轉(zhuǎn)化為0或1數(shù)據(jù)(此處有帶記為1,無帶記作0),直接輸入軟件SPSS(10.0版本)的數(shù)據(jù)錄入界面。采用歐氏距離系數(shù),運(yùn)用類間平均法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如下。從圖2可以看出,13種葉甲明顯聚為4類,其中前兩類為螢葉甲亞科,后面的分別是跳甲亞科和葉甲亞科?？傮w來看,相同的亞科聚為一類,并且亞科內(nèi)各屬也聚為一類。亞科以下階元的聚類結(jié)果和形態(tài)學(xué)分類相一致,說明以酯酶同工酶作為研究手段,進(jìn)行葉甲類昆蟲亞科以下階元的分類是可行的,同時(shí)也說明了它們酯酶同工酶酶譜的差異和其分類地位是一致的。從聚類結(jié)果看,跳甲亞科和葉甲亞科先聚為一類,然后再和螢葉甲亞科聚為一類。3酯酶同工酶的結(jié)構(gòu)和分類酯酶同工酶在動(dòng)物體內(nèi)不僅含量豐富,而且組成復(fù)雜,這組酶既受DNA不同位點(diǎn)的控制,同時(shí)又受到同一位點(diǎn)不同等位基因的控制,因而表現(xiàn)的酶譜很復(fù)雜(韓雅莉等,1999)。從本項(xiàng)研究看,13種葉甲的酯酶同工酶酶譜及聚類分析結(jié)果分為4類,與形態(tài)特征分類結(jié)果相一致,郭曉霞等指出在低級(jí)階元(亞科以下水平)的分類中,酯酶同工酶位點(diǎn)獨(dú)立進(jìn)化的時(shí)間相對(duì)較短,加之階元內(nèi)類群基本屬于同一生態(tài)型,其酶譜的差異和相似是真實(shí)的,尤其對(duì)于那些遺傳結(jié)構(gòu)上分化較大而外部形態(tài)變化不大的種類之間,酯酶同工酶具有鑒別性意義,酯酶同工酶具有多態(tài)性在昆蟲分類學(xué)中有一定的應(yīng)用價(jià)值(郭曉霞等,2000),因此筆者認(rèn)為葉甲科昆蟲在亞科以下階元的系統(tǒng)分類中酯酶同工酶可以作為一種分類學(xué)研究手段。從3亞科的聚類結(jié)果看,跳甲亞科和葉甲亞科先聚為一類,然后再和螢葉甲亞科聚為一類。Brian,DF通過研究留有葉甲蠶食痕跡的植物葉子化石,推測(cè)葉甲總科的進(jìn)化史,顯示在中生代石炭紀(jì)中期形成了葉甲亞科分支與螢葉甲亞科和跳甲亞科分支,在新生代中期螢葉甲亞科和跳甲亞科分支分化為兩個(gè)獨(dú)立發(fā)展的分支(Brian,DF,1998),筆者的研究結(jié)果與前人不符。研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能是:螢葉甲亞科和跳甲亞科分化后,其酯酶同工酶的編碼基因進(jìn)化速率比較快,基因變異較大;而跳甲亞科酯酶同工酶的編碼基因進(jìn)化速率比較慢,且包含有較多的祖先遺傳信息,從而導(dǎo)致在酯酶酶譜表現(xiàn)上跳甲亞科和葉甲亞科的親緣關(guān)系比較近這一