線粒體基因組的序列分析

線粒體基因組的序列分析

人體是結(jié)構(gòu)和能量的結(jié)合體，衰老是隨著年齡的推移而發(fā)生的自然衰退現(xiàn)象。抵抗這種自然衰退需要能量修補(bǔ)或重建被損的功能。線粒體是一個(gè)敏感而多變的細(xì)胞呼吸器官。除細(xì)菌、藍(lán)綠藻和哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞以外,所有的真核細(xì)胞都有線粒體。線粒體具有三羧酸循環(huán)、電子傳遞和氧化磷酸化(oxidativephosphorylation,OXPHOS)的作用,線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應(yīng)為有機(jī)體生成約90%的能量(ATP),因而被稱為細(xì)胞的氧化中心和“動(dòng)力工廠”。線粒體是除細(xì)胞核之外唯一含有DNA的細(xì)胞器,并擁有自己的遺傳密碼和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。因此,線粒體除了能量轉(zhuǎn)換作用,還與活性氧類(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成、細(xì)胞氧化還原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等相關(guān),涉及生物體的進(jìn)化、發(fā)育、遺傳、代謝、衰老、心血管疾病、神經(jīng)-肌肉疾病、惡性腫瘤以及細(xì)胞死亡等多個(gè)重要問(wèn)題。由于線粒體的生物學(xué)功能受細(xì)胞核和線粒體兩個(gè)遺傳體系的交叉控制,許多線粒體基因組和相關(guān)核基因組的變異,常與多種人體重要疾病的發(fā)生直接相關(guān),線粒體疾病(mitochondrialdiseases)和線粒體醫(yī)學(xué)(mitochondrialmedicine)已經(jīng)發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)的新生長(zhǎng)點(diǎn)。1人類的基礎(chǔ)教育1.1人線粒體基因組mthnda人線粒體基因組(humanmitochondrialgenome)包括1500多個(gè)基因,分屬于線粒體DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)和核基因組DNA(nuclearDNA,nDNA)兩個(gè)部分。除mtDNA自身編碼的37個(gè)基因外,其余與線粒體結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因均由nDNA編碼。nDNA編碼線粒體的聚合酶、核糖體蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和酶等蛋白質(zhì)分子。但一般以mtDNA作為人線粒體基因組的代名詞。1981年,劍橋大學(xué)的Anderson等測(cè)定了人mtDNA的全序列,故線粒體基因組序列又稱劍橋序列(CambridgeReferenceSequence,CRS)。人mtDNA為一條雙鏈環(huán)狀DNA分子,含16569bp,編碼2種rRNA(12SrRNA、16SrRNA)、22種tRNA和13種蛋白質(zhì)亞基的基因,共37個(gè)基因。1999年,Andrew等重新測(cè)序了Anderson等所用的原胎盤組織樣本的mtDNA,糾正了18個(gè)序列差錯(cuò),包括7個(gè)罕見(jiàn)的DNA多態(tài)性:263A、311C-315C、750A、1438A、4769A、8860A和15326A,11個(gè)測(cè)序錯(cuò)誤:3107del、3423T、4985A、9559C、11335C、13702C、14199T、14272C、14365C、14368C和14766C。截止2006年1月18日,國(guó)際公認(rèn)的人線粒體基因組序列為2001年的修正版(RevisedCRS,rCRS)。然而,人線粒體基因組實(shí)際全長(zhǎng)為16568bp,原第3107位的堿基是不存在的。只是考慮到已經(jīng)約定俗成,故仍然把mtDNA的全長(zhǎng)定為16569bp,將缺失的第3107位的堿基(3107del)表示為“X”。1.2mtcda的遺傳多樣性與人核DNA的31億堿基對(duì)、3~4萬(wàn)個(gè)基因的龐大組成相比,人mtDNA的大小相差甚遠(yuǎn)。但是,mtDNA的突變有其特殊的遺傳特征:①母系遺傳。一個(gè)卵母細(xì)胞大約擁有10~20萬(wàn)個(gè)線粒體,每個(gè)線粒體至少含有幾個(gè)DNA分子。但每個(gè)精子只有幾百個(gè)線粒體,因而mtDNA的遺傳表現(xiàn)為母系遺傳(maternalinheritance),母親所攜帶的mtDNA突變可遺傳給所有的子女(男或女)。②異質(zhì)性(heteroplasmy)。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)mtDNA發(fā)生突變時(shí),細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在野生型和突變型兩種類型的mtDNA。③閾值效應(yīng)(threshold)。突變mtDNA分子的數(shù)量只有在達(dá)到某種程度時(shí)才足以引起人體器官或組織的功能異常。④廣譜性。mtDNA的任何突變都可能累及人體基因組中的重要功能區(qū)域部分,使得病理性mtDNA突變極為常見(jiàn)。⑤高突變率。mtDNA的突變率比nDNA高10倍以上。2導(dǎo)致細(xì)胞活力缺失目前的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的“電站”——線粒體需要一定的化學(xué)物質(zhì)來(lái)保證細(xì)胞的活力和清除細(xì)胞的毒素。如果這個(gè)“充電”過(guò)程減弱,細(xì)胞能量枯竭,則容易導(dǎo)致心肌梗塞、慢性疲勞和神經(jīng)退行性疾病等。例如,nDNA的突變可影響有關(guān)OXPHOS的結(jié)構(gòu)基因和組裝基因、mtDNA維持基因以及線粒體融合和移動(dòng)基因的功能,而編碼OXPHOS酶亞基基因的嚴(yán)重突變將導(dǎo)致一種常見(jiàn)的兒童致死疾病——Leigh綜合征。2.1mtcda的變異性線粒體在氧化過(guò)程中,產(chǎn)生大量的ROS(H2O2、O2-、HO2、OCl-和OH-等),ROS可激活線粒體透性轉(zhuǎn)變通道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mtPTP),造成能量缺損和氧化性損傷,引起細(xì)胞凋亡。由于長(zhǎng)期遭受ROS的攻擊,導(dǎo)致哺乳動(dòng)物mtDNA具有極高的突變率。因此,mtDNA分子雖然較小,但mtDNA疾病卻很常見(jiàn)。1956年,Harman首先提出衰老的自由基假說(shuō),之后又認(rèn)為在人類衰老過(guò)程中mtDNA是自由基攻擊的主要目標(biāo),線粒體可被看作一座“衰老鐘”(agingclock)。20世紀(jì)80年代初,Miquel等提出“細(xì)胞衰老學(xué)說(shuō)”,認(rèn)為衰老是由細(xì)胞分化及隨后氧自由基攻擊mtDNA造成的。1988年,Holt等首次證實(shí)線粒體疾病與線粒體突變之間存在關(guān)聯(lián)。1989年,Linnane提出mtDNA突變的累積是衰老的重要原因。以后數(shù)十余年間,學(xué)者們又發(fā)現(xiàn)許多與衰老相關(guān)的退行性疾病(衰老病),包括Alzheimer病、Parkinson綜合征、Huntington舞蹈癥、脊髓側(cè)索性硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)、心肌病(cardiomyopathies)、糖尿病和惡性腫瘤等,其主要病因是mtDNA的變異。1995年,Ozawa提出衰老的線粒體氧化還原機(jī)制,即mtDNA的氧化損傷引起mtDNA突變的累積,導(dǎo)致能量產(chǎn)出缺陷、衰老和細(xì)胞死亡。mtDNA突變是退行性疾病普遍存在的現(xiàn)象,主要包括點(diǎn)突變、缺失突變和DNA重排,其中DNA片段的缺失與衰老及疾病的關(guān)系較為密切。常見(jiàn)的點(diǎn)突變有:①位于tRNALeu基因第3243位點(diǎn)的A→G突變,引起線粒體腦肌病伴乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS);②tRNALys基因第8344位點(diǎn)的A→G突變,常見(jiàn)于肌陣攣性癲癇伴碎紅肌纖維(MERRF);③ATPase6基因第8993位點(diǎn)的T→G突變,常見(jiàn)于神經(jīng)性肌無(wú)力、共濟(jì)失調(diào)及視網(wǎng)膜色素沉著;④ND4基因第11778位點(diǎn)的G→A突變,引起Leber視神經(jīng)萎縮(LHON);⑤tRNAIle基因第4269位點(diǎn)的A→G突變,導(dǎo)致心肌病;⑥tRNAGln基因第4336位點(diǎn)的G突變,可見(jiàn)于5%的晚發(fā)型Alzheimer病患者和7%的Alzheimer病與Parkinson病并發(fā)患者;⑦mtDNA調(diào)控區(qū)(CR)T414G突變,可見(jiàn)于63%的Alzheimer病患者。較常見(jiàn)的與衰老相關(guān)的缺失突變則是4977bp~5kb片段的缺失,在心、骨骼肌和腎等各臟器中均可找到該突變,稱之為“共有缺失”。在嬰幼兒中未檢測(cè)到此種缺失,但在年長(zhǎng)者的多種組織中均存在。此外,在老年人中還發(fā)現(xiàn)了7.4kb、6.0kb和3.6kb的缺失片段,甚至在1個(gè)退行性腦肌病患者中發(fā)現(xiàn)從復(fù)合物II基因至細(xì)胞色素b基因之間的特長(zhǎng)片段缺失。上述缺失大多在穩(wěn)定組織(如神經(jīng)、肌肉組織)中比例較高,而在血細(xì)胞等細(xì)胞快速分裂的組織中則較少見(jiàn)。在衰老相關(guān)性退行性疾病中,可觀察到mtDNA缺失突變的顯著增加。例如,與正常個(gè)體相比,5kb缺失片段在慢性冠心病患者中升高了7~2200倍;在<75歲的Alzheimer病患者中平均升高15倍,在>75歲的Alzheimer病患者中則占了1/5的比例。以往認(rèn)為,在人、猴和嚙齒類動(dòng)物的衰老過(guò)程中,mtDNA所發(fā)生的點(diǎn)突變和缺失會(huì)在各種組織中積累起來(lái),在某些細(xì)胞中呈不均衡分布,并發(fā)生克隆性累積,從而導(dǎo)致諸如心、骨骼肌和腦等組織細(xì)胞呼吸鏈功能的缺陷。但這種缺損對(duì)衰老的影響一直沒(méi)有直接證據(jù),故長(zhǎng)期存在爭(zhēng)論。2004年,Larsson實(shí)驗(yàn)小組通過(guò)基因工程手段育成PolgA酶有缺陷的小鼠,使小鼠的mtDNA聚合酶的校對(duì)活性下降,使之具有較高的突變速率(點(diǎn)突變發(fā)生率提高了3~5倍),缺失的mtDNA數(shù)量也有所上升。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這種散在性的mtDNA突變與小鼠的短壽密切相關(guān),mtDNA突變小鼠出現(xiàn)與早衰相關(guān)的癥狀:體重減輕、皮下脂肪減少、脫毛、脊柱彎曲、骨質(zhì)疏松、貧血、生殖力下降和心臟肥大,并在12個(gè)月左右死亡(正常小鼠24~36個(gè)月死亡)。這表明,mtDNA突變與衰老表現(xiàn)型之間存在因果關(guān)系。2.2嘴唇氧化應(yīng)激與nDNA相比,mtDNA更容易遭受氧化損傷和誘變?cè)吹墓?原因可能在于:①線粒體內(nèi)膜的脂類含量高,親脂性誘導(dǎo)突變的化合物易在mtDNA附近積聚;②mtDNA沒(méi)有組蛋白保護(hù);③mtDNA缺乏完善的DNA切除修復(fù)機(jī)制;④mtDNA沒(méi)有內(nèi)含子,任何突變都能影響DNA的編碼序列。根據(jù)衰老過(guò)程的線粒體理論,mtDNA所發(fā)生的突變的積累,會(huì)導(dǎo)致生物體發(fā)生漸進(jìn)性能量缺乏、細(xì)胞損傷和退化,mtPTP開(kāi)放增加,以致凋亡因子(如細(xì)胞色素C,procaspase2、3、9和凋亡誘導(dǎo)因子AIF)由線粒體內(nèi)外膜間釋放,最終引起細(xì)胞凋亡。已發(fā)現(xiàn)線粒體氧化應(yīng)激(oxidativestress)是細(xì)胞凋亡的早期事件。例如,無(wú)論秀麗線蟲(chóng)還是酵母,都可通過(guò)過(guò)表達(dá)NAD+-依賴性蛋白脫乙酰酶Sir2基因來(lái)延壽。Sir2的部分功能是利用forkhead轉(zhuǎn)錄因子的脫乙酰化和激活作用,幫助其在核內(nèi)重新定位和轉(zhuǎn)錄激活。研究發(fā)現(xiàn),線粒體OXPHOS缺陷將增加NADH/NAD+的比例,抑制SIR2,促進(jìn)forkhead轉(zhuǎn)錄因子的乙酰化,關(guān)閉抗氧化和應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá),降低抗氧化防護(hù)功能,導(dǎo)致衰老。相關(guān)哺乳動(dòng)物衰老的研究,與已報(bào)道的秀麗線蟲(chóng)、果蠅等無(wú)脊椎動(dòng)物的研究結(jié)果吻合。衰老是引起神經(jīng)退行性疾病(包括Alzheimer病、Parkinson綜合征和ALS等)的主要危險(xiǎn)因素,許多研究顯示氧化應(yīng)激參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。腦線粒體受到氧化應(yīng)激的程度較肝線粒體為重,這與衰老時(shí)神經(jīng)元的損傷比肝細(xì)胞更為嚴(yán)重的觀察結(jié)果相吻合。但在2005年,Kujoth等培育出POLG校對(duì)活性缺陷致mtDNA突變累積的小鼠動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠的mtDNA受損速度加快,進(jìn)而出現(xiàn)掉毛、白毛、脊椎骨彎曲等現(xiàn)象,并罹患老年性耳聾。實(shí)驗(yàn)小鼠只能活15個(gè)月。Kujoth等發(fā)現(xiàn)正常小鼠和實(shí)驗(yàn)小鼠線粒體的氧化應(yīng)激沒(méi)有量的區(qū)別,提出一向被認(rèn)為是促進(jìn)衰老的ROS與衰老無(wú)關(guān)。3細(xì)胞基因治療mtDNA疾病的治療既可在代謝水平上,也可在基因水平上。代謝治療是指增加線粒體產(chǎn)能輸出,減少ROS的生成,穩(wěn)定mtPTP的措施。例如,服用維生素E和C等抗氧化劑,可減慢Alzheimer病癡呆的發(fā)展,增強(qiáng)血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能,改善患者的記憶力和認(rèn)知行為?；蛑委焺t包括體細(xì)胞基因治療(改善患者臨床癥狀)和生殖細(xì)胞基因治療(徹底消除致病基因)兩類。體細(xì)胞基因治療可通過(guò)3種途徑實(shí)現(xiàn):①直接校正nDNA編碼的突變線粒體基因;②將正常mtDNA基因?qū)爰?xì)胞核內(nèi),使之生成正常的多肽鏈,重新轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體,恢復(fù)正常功能;③直接修正突變的mtDNA。例如,Seo等于19