不同含水量刺槐種子萌發(fā)特性及生理生化指標(biāo)測定

不同含水量刺槐種子萌發(fā)特性及生理生化指標(biāo)測定

種子超干貯藏是指種子含水量降至5%以下，種子在密封條件下或稍冷下保存的一種方法。常用于種質(zhì)資源和高價(jià)值種子的長期保存。傳統(tǒng)的低溫貯藏的建庫投資和操作運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用相當(dāng)高,對發(fā)展中國家是一個(gè)較大的負(fù)擔(dān),而超干種子貯藏簡便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用,應(yīng)用前景廣泛。1985年,國際植物資源委員會(huì)首先提出對某些作物種子采用超干貯存的設(shè)想,1986年,英國里丁大學(xué)首先開始超干種子研究。鄭光華等在我國開展超干種子貯藏研究,20多年來,對多數(shù)農(nóng)作物種子的超干保存技術(shù)研究取得了很大的成果,但是對于林木種子的超干儲(chǔ)存研究僅限于馬尾松、杉木、西南樺等。對種源不同的林木種子超干貯藏特性未見報(bào)道。刺槐是干旱半干旱地區(qū)的主要造林樹種,本試驗(yàn)首次研究超干及其老化處理對刺槐種子的活力和生理生化特性,獲得刺槐種子超干儲(chǔ)藏特性及其生理生化變化規(guī)律,為干旱半干旱地區(qū)植被恢復(fù)提供依據(jù),為刺槐種子種質(zhì)資源的保存和其它林木種子的相關(guān)研究和貯藏提供參考。1材料和方法1.1仿真試驗(yàn)和貯藏試驗(yàn)刺槐種子于2007年秋采自陜西省延安市和陜西省吳起縣,原始含水率分別為6.9%和7.4%,千粒重分別為(18.53±0.34)g和(16.62±0.48)g,采種量各5kg,試驗(yàn)前,種子置于敞口的布袋中,貯存在通風(fēng)的室內(nèi)(溫度15～18℃,相對濕度35%～45%)。1.2方法1.2.1特征膠的制備種子置于紗布袋中,放在下層為硅膠的干燥器中。硅膠與種子質(zhì)量比為10∶1,每天更換經(jīng)120℃烘干冷卻至室溫的干硅膠。每5d定時(shí)稱重,制備不同含水量的超干種子。超干種子密封于具塞試管中。1.2.2超干種子的干燥處理種子密封于具塞試管中,置于50℃生化培養(yǎng)箱中老化30d。1.2.3水處理系統(tǒng)不同溫度對cacl2和nacl2的耐水處理樣品處理超干處理和超干老化處理的種子,測定指標(biāo)前,先將種子置于底部盛有飽和CaCl2溶液的干燥器中(相對濕度35%),室溫(15～18℃)回水處理2d,然后轉(zhuǎn)移至盛有飽和NaCl溶液的干燥器中(相對濕度75%),室溫回水處理2d后,取出至室溫放置。1.2.4發(fā)芽試驗(yàn)試驗(yàn)按《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB2722-1999的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)100粒種子,種子經(jīng)85℃溫水自然冷卻浸泡24h,未吸脹種子劃破種皮,用去離子水充分沖洗干凈,置于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中,置于25℃培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)14d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。1.2.5浸泡時(shí)間對電導(dǎo)率的影響取50粒種子稱重,用去離子水沖洗數(shù)次,吸干表面水分,置帶蓋的器皿中,加100ml去離子水,于28℃浸泡2,4,6,8,10h,用電導(dǎo)儀(delta326,上海制造)測定浸泡液電導(dǎo)率(Ci,i=2,4,6,8,10)然后加熱煮沸10min冷卻至28℃測定電導(dǎo)率(C0)。重復(fù)3次。相對電導(dǎo)率按照以下公式計(jì)算:相對電導(dǎo)率(%)=100Ci/C0。1.2.6ttf值的測定TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法,刺槐種子每樣20粒稱重,3個(gè)重復(fù),劃破種皮,45℃溫水室內(nèi)自然冷卻浸種24h(室溫15～18℃),剝掉種皮,加10ml0.1%TTC溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配),放在38℃的恒溫水浴中(加蓋保持黑暗條件)染色4h,用雙蒸水沖洗2～3次,以粗濾紙吸去浮水,加少許分析純石英砂及丙酮研磨,將研磨液倒入10ml的容量瓶中定容,將提取液和殘?jiān)?000r/min下離心10min,上清液在波長490nm處測定密度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原態(tài)TTC值。1.2.7紫外分光光密度測定取刺槐種子每樣20粒,3個(gè)重復(fù),劃破種皮,45℃溫水室內(nèi)自然冷卻浸種24h,剝掉種皮,加入少量分析純石英砂和5ml研磨緩沖液研磨沖洗,轉(zhuǎn)移到試管中,將提取液放在70℃恒溫中加熱20min,一層紗布過濾后4000r/min離心5min,傾出上清液,用研磨緩沖液定容至10ml作為酶制劑,吸取1ml酶制劑放入試管中,加入1ml淀粉溶液和1ml反應(yīng)緩沖液,搖勻放在37℃的恒溫水浴中保溫,經(jīng)過0、5、10min,分別吸取0.3ml的反應(yīng)混合液放入試管中,迅速加入1ml顯色劑,加入3ml蒸餾水,充分搖勻,用TU-1801紫外可見分光光度計(jì)在620nm的波長下測定其光密度值,得到OD620(0)、OD620(5)、OD620(10),計(jì)算5min和10min的光密度變化值ΔOD620(5)和ΔOD620(10)。淀粉酶[mg/(粒·min)]=ΔOD620(t)av/v1OD620(0)twmin)]=ΔΟD620(t)av/v1ΟD620(0)twOD620(0)為0min的光密度值,ΔOD620(t)為時(shí)間t的光密度變化值,t為反應(yīng)時(shí)間,a為每次試驗(yàn)樣品混合液中含淀粉毫克數(shù)(0.3ml混合液含有0.1ml淀粉溶液,含淀粉0.1mg),v為提取的酶制劑總體積(10ml),w為種子粒數(shù),v1為每次測定用酶制劑體積(0.3ml混合液含有0.1ml酶制劑)。1.3數(shù)據(jù)分析方差分析與多重比較應(yīng)用SPSS11.5軟件輔助完成。試驗(yàn)于2007年11月～2008年3月在國家林業(yè)局北方林木種子檢驗(yàn)中心完成。2結(jié)果與分析2.1種子含水量對發(fā)芽率的影響吳起種源刺槐種子的干燥速率快于延安種源刺槐種子(圖1),刺槐種子初始含水量延安種源低于吳起種源,千粒重高于吳起種源,發(fā)芽率低于吳起種源,刺槐種子均為當(dāng)年同期采種,同一自然條件下干燥,原因可能為延安種源刺槐種子完成后熟的效果弱于吳起種源,在浸種發(fā)芽過程中,浸種后的刺槐種子硬粒數(shù)吳起種源多于延安種源。延安種源刺槐種子超干燥后回濕處理,種子發(fā)芽率均低于自然干燥含水量種子(含水量6.9%),種子含水量降至4.2%時(shí),發(fā)芽率降幅較大。吳起種源刺槐種子超干后回濕,當(dāng)含水量不低于4.3%時(shí),種子發(fā)芽率比自然干燥種子(含水量7.4%)有一定程度的提高(表1),這與濕干交替處理有利于種子活化,種子內(nèi)部生理過程受到促進(jìn),加速種子發(fā)芽有關(guān)。干燥種子50℃老化30d后,經(jīng)回濕處理,發(fā)芽率表現(xiàn)出顯著性差異(表1),說明含水量對種子抗老化的能力影響顯著。老化后,延安種源含水量4.8%的種子和吳起種源為含水量4.3%的種子發(fā)芽率最高,說明后熟度對種子耐超干燥的能力有較顯著的影響。2.2膜的選擇透性與種子劣變的關(guān)系膜系統(tǒng)在細(xì)胞的各種生理及生化作用上,起著無比重要的作用。當(dāng)種子發(fā)生劣變時(shí),細(xì)胞膜受到損傷,透性增大,在浸出液中會(huì)析出較多的電解質(zhì),因而測得的電導(dǎo)率較高。對于同一樹種,種子自身存在著較大差異。相對電導(dǎo)率在比較各品種之間電導(dǎo)率差異時(shí)采用較多,最近一些種子保存特性的研究也采用相對電導(dǎo)率,一方面避免所選種子自身差異造成對觀測效果的混淆,一方面能夠直觀地描述細(xì)胞膜的選擇透性在種子劣變過程中的變化。延安種源刺槐種子超干燥后回濕,當(dāng)含水量不低于4.8%時(shí),相對電導(dǎo)率無顯著變化(圖2),含水量降至4.2%時(shí),相對電導(dǎo)率顯著增加,細(xì)胞膜的選擇透性最差,超干后回濕措施沒有對細(xì)胞膜產(chǎn)生顯著修復(fù)。吳起種源刺槐種子含水量不低于4.3%時(shí),超干燥后回濕種子相對電導(dǎo)率無顯著性變化(圖4),當(dāng)含水量降至3.8%時(shí),種子相對電導(dǎo)率顯著性升高,則細(xì)胞膜的選擇透性最差。老化30d后,種子相對含水量均高于老化前的含水量,種子均發(fā)生一定程度的劣變。延安種源含水量4.8%的種子相對電導(dǎo)率最低,細(xì)胞膜具有相對較好的選擇透性(圖3)。吳起種源超干燥刺槐種子的相對電導(dǎo)率均低于含水量7.4%的種子,超干燥種子細(xì)胞膜選擇透性較好(圖5)。超干后和老化后種子的相對電導(dǎo)率,延安種源均明顯高于吳起種源,吳起種源種子的細(xì)胞膜選擇透性好于延安種源,這與吳起種源刺槐種子后熟度高,硬實(shí)率高有關(guān),研究表明硬實(shí)的種子,對成熟期間和貯藏期間不良條件的抵抗能力較強(qiáng),易于保持較高活力。2.3種子含水率對刺槐種子脫氫酶活性的影響種子脫氫酶活性與種子活力關(guān)系密切,是種子生活力和活力的最重要生理指標(biāo)之一,可反應(yīng)細(xì)胞代謝的還原能力和胚損傷程度。脫氫酶活性測定采用TTC定量法,是對種子染色的定量分析。超干燥處理回濕后,延安種源刺槐種子脫氫酶活性自然干燥含水量最高,當(dāng)含水量不低于4.3%時(shí),吳起種源超干燥刺槐種子脫氫酶活性均高于自然干燥含水量種子,這與濕干交替促進(jìn)種子活力有關(guān)。當(dāng)種子含水量降至3.8%時(shí),刺槐種子脫氫酶活性顯著性低于自然干燥含水量種子。因此,刺槐種子脫氫酶活性受含水量影響較大,種子耐干燥的能力有一定的限制,從延安種源和吳起種源刺槐種子脫氫酶變化來看,不同種源地對刺槐脫氫酶活性變化也有顯著影響。超干燥種子50℃老化30d后,經(jīng)回濕處理,脫氫酶表現(xiàn)出顯著性差異(表2)。一定超干燥含水量范圍內(nèi)(延安種源>4.8%,吳起種源>4.3%),種子脫氫酶活性均高于自然干燥含水量種子。延安種源含水量為4.8%刺槐種子脫氫酶活性最高,吳起種源含水量為4.3%刺槐種子脫氫酶活性最高。對于延安種源刺槐種子,種質(zhì)相對較差,盡管具有一定耐超干燥的能力,超干后回濕的發(fā)芽率低于自然含水量種子。種質(zhì)較好的吳起種源刺槐種子超干燥后回濕種子活力提高,且具有較強(qiáng)的抗老化能力,適合超干燥保存。2.4種子抗氧化能力的變化當(dāng)種子萌發(fā)時(shí),淀粉為淀粉酶所分解。α-淀粉酶是在發(fā)芽過程中形成的,其活性隨萌發(fā)時(shí)間的延長而增高,種子萌發(fā)過程中,α-淀粉酶可將淀粉分解為糊精和麥芽糖,從另一個(gè)側(cè)面反映了種子活力。5min內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明:延安種源刺槐種子自然干燥含水量種子α-淀粉酶活性高于超干燥含水量種子,當(dāng)含水量不低于4.3%時(shí),吳起種源刺槐種子α-淀粉酶活性高于自然干燥含水量種子,當(dāng)含水量低于3.8%時(shí),α-淀粉酶活性低于自然干燥含水量的種子。10min內(nèi)α-淀粉酶活性表現(xiàn)出與5min內(nèi)相一致的規(guī)律(表2)。超干燥種子50℃老化30d后,經(jīng)回濕處理,α-淀粉酶活性表現(xiàn)出顯著性差異(表2)。延安種源含水量為4.8%刺槐種子5min和10min內(nèi)α-淀粉酶活性均最高,吳起種源含水量為4.3%刺槐種子α-淀粉酶活性最高。延安種源刺槐種子盡管一定超干燥含水量范圍(含水量>4.8%)內(nèi),種子抗老化能力較強(qiáng),但是超干后回濕種子α-淀粉酶活性均低于自然干燥種子。吳起種源刺槐種子當(dāng)含水量不低于4.3%時(shí),超干后回濕和老化30d后,α-淀粉酶活性均高于自然干燥含水量種子,適合超干燥保存。3種子超干燥貯藏(1)種子超干燥貯藏是種子界研究的熱點(diǎn),試驗(yàn)已證明,許多種子都可進(jìn)行超干燥貯藏,但不同類型的種子耐干程度差異較大,同一種子的不同品種間的研究在農(nóng)作物中已有報(bào)道,種源地和種質(zhì)對種子耐干性的研究尚未見報(bào)道,對延安種源和吳起種源的刺槐種子的研究表明,種源地對于種子的耐超干性具有一定的作用。因此,在種子的超干燥貯藏過程中,在依據(jù)某一種子超干燥研究成果的同時(shí),要充分考慮所貯藏種子的種質(zhì)。(2)本試驗(yàn)采用硅膠室溫干燥法獲得超干燥種子,對刺槐的超干燥過程比較緩慢。有研究表明,干燥速率對種子活力也有一定程度的影響。人工老化的方法證明,刺槐種子超干燥貯藏的優(yōu)越性的同時(shí),尚需實(shí)際貯藏驗(yàn)證。4種子貯藏穩(wěn)定性(1)刺槐種子超干后回濕處理,延安種源刺槐種子含水量不低于4.8%時(shí),種子發(fā)芽率、