高效液相色譜法測定角倍單寧酸的含量

高效液相色譜法測定角倍單寧酸的含量

5倍子多胞菌屬（），屬于漆樹科，是由復葉葉、小葉和總軸組成的昆蟲。這是中國傳統(tǒng)的森林產(chǎn)品和貢品[1.2]。五倍子的主要成分為五倍子單寧,其含量一般在60%以上。以五倍子為原料生產(chǎn)的單寧酸、沒食子酸、焦性沒食子酸和抗菌素增效劑(TMP)等,廣泛應用于醫(yī)藥、染料、稀有金屬提取、石油鉆井、紡織品印染與固色、食品防腐、油脂抗氧化、飲料澄清和三廢處理等。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展及分析水平的提高,五倍子單寧的用途日趨廣泛[4~7]。單寧又名鞣酸、單寧酸,是一類具有生物活性的多酚物質(zhì),其多酚羥基的結(jié)構(gòu)賦予了它一系列獨特的化學特性和生理活性,如與蛋白質(zhì)有強烈的結(jié)合能力,與生物堿、酶、金屬離子等反應活潑,還有較強的表面活性,對人體的一些傷病有直接的生物療效[8~9]。五倍子單寧在國際上稱為中國單寧,中國藥典上稱為單寧酸,水解時產(chǎn)生沒食子酸,是最早在化學結(jié)構(gòu)上受到詳細研究的單寧之一。目前國內(nèi)外應用的單寧主要從含有單寧的天然植物及植物蟲癭五倍子中采用水或其它溶劑提取。單寧的測定方法有經(jīng)典方法和現(xiàn)代方法,經(jīng)典方法包括皮粉法、容量法、比色法和分光光度法,現(xiàn)代方法包括高效液相色譜法(HPLC)、原子吸收分光光度法、薄層掃描法、熱透鏡光譜法、高靈敏示波電位動力學分析法和電化學傳感器法等。本文以角倍為試驗材料,分別采用皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法測定中國五倍子主產(chǎn)區(qū)7省(市)14個產(chǎn)地的單寧酸含量,旨在比較各種測定方法的優(yōu)劣,尋找準確、快速的五倍子單寧測定方法,為五倍子質(zhì)量評價提供科學依據(jù),并為其他植物單寧的測定提供借鑒。1材料和方法1.1中國五倍子產(chǎn)區(qū)角倍于2009、2010年10月上旬分別采自云南(鹽津)、貴州(綏陽、湄潭、臺江、印江)、四川(峨眉、萬源)、湖南(張家界、桑植、古丈)、湖北(竹山、五峰)、陜西(西鄉(xiāng))和重慶(酉陽),上述地區(qū)均位于中國五倍子主產(chǎn)區(qū)。在林間采集成熟但尚未爆裂的倍子,帶回室內(nèi)烘干、冷卻、粉碎后過60目篩,密封,置陰涼干燥處備用。1.2儀器、藥物和試劑1.2.1試劑的配制十萬分之一電子天平,恒溫水浴鍋,振蕩器,遠紅外干燥箱,平底蒸發(fā)皿,濾紙,漏斗、容量瓶等其他玻璃器皿。紗布、濾布:脫脂紗布和100目白夏布,使用前用蒸餾水煮沸和洗滌幾次,除去雜質(zhì);用后再煮沸幾次備用,不能用肥皂洗。經(jīng)過改裝的卜氏浸提器。鉻皮粉:略帶灰藍色羊絨狀粉末,符合標準LY/T1639-2005-1;高嶺土(AR),蒸餾水,其余試劑均為分析純。溶液配制:(1)1%明膠NaCl溶液:取1.0g化學純明膠加10g分析純NaCl,溶于100mL水中,水溫不超過60℃,溶液pH值為4.7(可用酸或堿調(diào)節(jié)),現(xiàn)用現(xiàn)配。(2)1%FeCl3溶液:取1.0gFeCl3·6H2O溶于100mL水中。1.2.2光光度計/濾紙墻十萬分之一電子天平,DU800紫外可見光分光光度計(美國貝克曼庫爾特公司),1cm石英比色皿,濾紙,擦鏡紙,漏斗,100mL容量瓶等玻璃器皿。定容全部采用蒸餾水。1.2.3超純水系統(tǒng)提效技術(shù)十萬分之一電子天平,高效液相色譜儀(HP-1200,美國安捷倫公司),真空泵,超聲清洗機,超純水系統(tǒng)。單寧酸標準品(含量≥99%,中國林科院南京林化所),甲醇(色譜純),磷酸、丙酮、乙醇(AR),微孔濾膜(Φ0.45μm)。1.3五倍子常數(shù)的測定1.3.1與復合劑含量的差按照國家標準“五倍子”(GB5848-86)進行提取。浸提結(jié)束前最后一次用1%FeCl3溶液檢驗,若浸提不完全,檢測液有藍色沉淀時,重新稱樣浸提。分別測定分析試液中的可溶物含量和皮粉吸收后的非單寧含量,兩者之差即單寧含量。(1)可溶物含量。可溶物含量(X1)以干基計,用百分數(shù)表示,按(1)式進行計算:式中,m———試樣的質(zhì)量,g;m1———50mL可溶物干殘渣的質(zhì)量,g;X2———試樣的水分含量,%。(2)非單寧含量。非單寧含量(X3)以干基計,用百分數(shù)表示,按(2)式進行計算:式中,m1———50mL非單寧溶液的殘渣質(zhì)量,g;m2———50mL空白液的殘渣質(zhì)量,g;1.2———鉻皮粉加入稀釋水的倍數(shù);0.075———鉻皮粉空白試驗的容許修正值,g/L;m———試樣的質(zhì)量,g;X2———試樣的水分含量,%。(3)單寧酸的含量。單寧含量(X4)以干基計,用百分數(shù)表示,按(3)式進行計算。1.3.2工作溶液的制備(1)稱取烘至恒重的標準單寧酸0.1g(稱準至0.0001g),溶于少量60~70℃的蒸餾水中,移入100mL容量瓶,冷卻,定容。吸取1mL移入100mL容量瓶,定容,即為標準單寧酸工作溶液。(2)稱取烘至恒重的試樣約0.1g(稱準至0.0001g),溶于少量60~70℃的蒸餾水中,移入100mL容量瓶內(nèi),冷卻,定容,得試樣溶液。吸取該試樣溶液1mL移入100mL容量瓶,定容,得試樣工作溶液。(3)吸取試樣溶液20mL于250mL干燥的廣口瓶中,加入0.4g鉻皮粉,振蕩10min,用中速濾紙過濾,吸取1mL濾液移入100mL容量瓶,定容,得非單寧工作溶液。(4)用紫外分光光度計在276nm處,以蒸餾水為參比,用1cm石英比色皿分別測定各工作溶液的吸光度,按(4)式計算試樣的單寧酸含量,以干基質(zhì)量百分數(shù)X2計算:式中,A0———試樣工作溶液的吸光度數(shù)值;A1———單寧酸標準樣品工作溶液的吸光度數(shù)值;A2———試樣中非單寧工作溶液的吸光度數(shù)值;m0———試樣質(zhì)量,g;m1———單寧酸標準樣品質(zhì)量,g;X1———試樣干燥失重的數(shù)值,%。1.3.3標準曲線的繪制(1)對照品溶液的制備:精密稱取單寧酸對照品100.0mg,用水溶解并定容至100mL,用0.45μm濾膜過濾即得濃度為1.0mg/mL的單寧酸對照品溶液。(2)供試品溶液的制備:同紫外分光光度法,用0.45μm濾膜過濾備測。(3)色譜條件:色譜柱為EclipseXDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),以甲醇-水-磷酸(85∶15∶0.070)為流動相,流速0.5mL/min,檢測波長275nm,柱溫30℃,進樣量2μl。在該條件下,標樣和五倍子樣品色譜圖見圖1。(4)標準曲線:取對照品溶液(1.0mg/mL)適量,分別稀釋成100,200,300,400,500,600,700,800μg/mL的溶液,以峰面積A為縱坐標,樣品濃度C(μg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線。計算,得回歸方程為:A=12.864C-69.181,r=0.9999。1.4ssr單次給藥后產(chǎn)品總安全量測定數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。對每個產(chǎn)地的樣品進行3次平行測定,測定結(jié)果間的差<1.5%,取算術(shù)平均值為單寧含量。不同方法測定結(jié)果的比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)和S-N-K多重比較及K-S正態(tài)性檢驗。2結(jié)果與分析2.13不同方法的結(jié)果2.1.1比例對不確定量表的影響不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為61.59%~68.30%,平均值為64.49%±2.31%(表1)。14個產(chǎn)地角倍樣品測定結(jié)果的標準差為0.02%~1.22%,平均標準差0.48%,其中有2個產(chǎn)地的標準差大于1%,分別為1.09%和1.22%,其余12個產(chǎn)地的標準差均小于1%,表明皮粉法的測定結(jié)果較穩(wěn)定,重復性好。2.1.2皮粉法或c不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為60.48%~69.95%,平均值為64.63%±2.59%(表1),單寧含量的變異范圍較皮粉法大。14個產(chǎn)地角倍樣品測定的標準差為0.21%~1.34%,平均標準差0.74%,其中有4個產(chǎn)地的標準差大于1%,分別為1.00%、1.19%、1.27%和1.34%,其余8個產(chǎn)地的標準差均小于1%,表明紫外分光光度法較皮粉法靈敏,穩(wěn)定性較皮粉法差。2.1.3紫外分光光度法與hplc法的比較不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為60.51%~69.98%,平均值為66.03%±2.75%(表1),單寧含量的變異范圍較皮粉法大,與紫外分光光度法基本一致。14個產(chǎn)地角倍樣品測定的標準差為0.22%~1.45%,平均標準差0.81%,其中有5個產(chǎn)地的標準差大于1%,變異為1.08%~1.45%,其余7個產(chǎn)地的標準差均小于1%,表明HPLC法較皮粉法靈敏,穩(wěn)定性較皮粉法差,與紫外分光光度法基本一致。單因素方差分析(One-wayANOVA)及S-N-K多重比較分析結(jié)果:皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法測定的臺江、峨眉、永定和西鄉(xiāng)的單寧含量差異不顯著;其余10個產(chǎn)地的單寧含量差異顯著,其中湄潭、印江、桑植和古丈4個產(chǎn)地中,3種方法的測定結(jié)果均有顯著差異,并以HPLC法測定值最高,紫外分光光度法測定值次之(湄潭除外),皮粉法測定值最低(表1)。表明HPLC法的靈敏度較紫外分光光度法和皮粉法高。2.23測量結(jié)果和誤差K-S正態(tài)性檢驗結(jié)果表明(表2):皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法的Z值分別為0.53,0.37和0.66,雙側(cè)P值分別為0.94,0.99和0.78,均大于0.05,表明3種方法的測量結(jié)果均遵從正態(tài)分布,測定誤差來源于隨機誤差。單因素方差分析(One-wayANOVA)結(jié)果:F=1.544,P=0.226>0.05(表3),表明3種方法的測量結(jié)果差異不顯著,即這3種方法均可用于五倍子單寧酸含量的測定。2.33測定時間和成本對3種方法的優(yōu)缺點進行綜合比較(表4),皮粉法對實驗設備要求不高,測定結(jié)果穩(wěn)定,成本低,但測定時間長,步驟繁瑣,需要較多的樣品量;紫外分光光度法的設備要求及測定成本中等,需要的樣品量少,但測定結(jié)果易受外界環(huán)境條件變化和雜質(zhì)的影響;HPLC法方便快捷,需要的樣品量極少,靈敏度高,但測定設備昂貴,成本高。因此,在五倍子單寧酸含量測定中可根據(jù)試驗要求和設備條件選擇使用。3種方法的測量結(jié)果比較對皮粉法、紫外分光光度法、高效液相色譜法的測量結(jié)果分別進行均數(shù)比較、正態(tài)檢驗和方差分析(F檢驗)。正態(tài)檢驗結(jié)果,3種方法的測量結(jié)果均呈正態(tài)分布,表明測定誤差來源于隨機誤差。F檢驗結(jié)果,3種方法的測量結(jié)果差異不顯著,即3種方法均可用于五倍子單寧酸含量的測定。皮粉法是國際制革化學家協(xié)會從多種建議