高效液相色譜法測(cè)定角倍單寧酸的含量

高效液相色譜法測(cè)定角倍單寧酸的含量

5倍子多胞菌屬（），屬于漆樹科，是由復(fù)葉葉、小葉和總軸組成的昆蟲。這是中國(guó)傳統(tǒng)的森林產(chǎn)品和貢品[1.2]。五倍子的主要成分為五倍子單寧,其含量一般在60%以上。以五倍子為原料生產(chǎn)的單寧酸、沒食子酸、焦性沒食子酸和抗菌素增效劑(TMP)等,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、染料、稀有金屬提取、石油鉆井、紡織品印染與固色、食品防腐、油脂抗氧化、飲料澄清和三廢處理等。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展及分析水平的提高,五倍子單寧的用途日趨廣泛[4~7]。單寧又名鞣酸、單寧酸,是一類具有生物活性的多酚物質(zhì),其多酚羥基的結(jié)構(gòu)賦予了它一系列獨(dú)特的化學(xué)特性和生理活性,如與蛋白質(zhì)有強(qiáng)烈的結(jié)合能力,與生物堿、酶、金屬離子等反應(yīng)活潑,還有較強(qiáng)的表面活性,對(duì)人體的一些傷病有直接的生物療效[8~9]。五倍子單寧在國(guó)際上稱為中國(guó)單寧,中國(guó)藥典上稱為單寧酸,水解時(shí)產(chǎn)生沒食子酸,是最早在化學(xué)結(jié)構(gòu)上受到詳細(xì)研究的單寧之一。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的單寧主要從含有單寧的天然植物及植物蟲癭五倍子中采用水或其它溶劑提取。單寧的測(cè)定方法有經(jīng)典方法和現(xiàn)代方法,經(jīng)典方法包括皮粉法、容量法、比色法和分光光度法,現(xiàn)代方法包括高效液相色譜法(HPLC)、原子吸收分光光度法、薄層掃描法、熱透鏡光譜法、高靈敏示波電位動(dòng)力學(xué)分析法和電化學(xué)傳感器法等。本文以角倍為試驗(yàn)材料,分別采用皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法測(cè)定中國(guó)五倍子主產(chǎn)區(qū)7省(市)14個(gè)產(chǎn)地的單寧酸含量,旨在比較各種測(cè)定方法的優(yōu)劣,尋找準(zhǔn)確、快速的五倍子單寧測(cè)定方法,為五倍子質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù),并為其他植物單寧的測(cè)定提供借鑒。1材料和方法1.1中國(guó)五倍子產(chǎn)區(qū)角倍于2009、2010年10月上旬分別采自云南(鹽津)、貴州(綏陽、湄潭、臺(tái)江、印江)、四川(峨眉、萬源)、湖南(張家界、桑植、古丈)、湖北(竹山、五峰)、陜西(西鄉(xiāng))和重慶(酉陽),上述地區(qū)均位于中國(guó)五倍子主產(chǎn)區(qū)。在林間采集成熟但尚未爆裂的倍子,帶回室內(nèi)烘干、冷卻、粉碎后過60目篩,密封,置陰涼干燥處備用。1.2儀器、藥物和試劑1.2.1試劑的配制十萬分之一電子天平,恒溫水浴鍋,振蕩器,遠(yuǎn)紅外干燥箱,平底蒸發(fā)皿,濾紙,漏斗、容量瓶等其他玻璃器皿。紗布、濾布:脫脂紗布和100目白夏布,使用前用蒸餾水煮沸和洗滌幾次,除去雜質(zhì);用后再煮沸幾次備用,不能用肥皂洗。經(jīng)過改裝的卜氏浸提器。鉻皮粉:略帶灰藍(lán)色羊絨狀粉末,符合標(biāo)準(zhǔn)LY/T1639-2005-1;高嶺土(AR),蒸餾水,其余試劑均為分析純。溶液配制:(1)1%明膠NaCl溶液:取1.0g化學(xué)純明膠加10g分析純NaCl,溶于100mL水中,水溫不超過60℃,溶液pH值為4.7(可用酸或堿調(diào)節(jié)),現(xiàn)用現(xiàn)配。(2)1%FeCl3溶液:取1.0gFeCl3·6H2O溶于100mL水中。1.2.2光光度計(jì)/濾紙墻十萬分之一電子天平,DU800紫外可見光分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司),1cm石英比色皿,濾紙,擦鏡紙,漏斗,100mL容量瓶等玻璃器皿。定容全部采用蒸餾水。1.2.3超純水系統(tǒng)提效技術(shù)十萬分之一電子天平,高效液相色譜儀(HP-1200,美國(guó)安捷倫公司),真空泵,超聲清洗機(jī),超純水系統(tǒng)。單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99%,中國(guó)林科院南京林化所),甲醇(色譜純),磷酸、丙酮、乙醇(AR),微孔濾膜(Φ0.45μm)。1.3五倍子常數(shù)的測(cè)定1.3.1與復(fù)合劑含量的差按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“五倍子”(GB5848-86)進(jìn)行提取。浸提結(jié)束前最后一次用1%FeCl3溶液檢驗(yàn),若浸提不完全,檢測(cè)液有藍(lán)色沉淀時(shí),重新稱樣浸提。分別測(cè)定分析試液中的可溶物含量和皮粉吸收后的非單寧含量,兩者之差即單寧含量。(1)可溶物含量?？扇芪锖?X1)以干基計(jì),用百分?jǐn)?shù)表示,按(1)式進(jìn)行計(jì)算:式中,m———試樣的質(zhì)量,g;m1———50mL可溶物干殘?jiān)馁|(zhì)量,g;X2———試樣的水分含量,%。(2)非單寧含量。非單寧含量(X3)以干基計(jì),用百分?jǐn)?shù)表示,按(2)式進(jìn)行計(jì)算:式中,m1———50mL非單寧溶液的殘?jiān)|(zhì)量,g;m2———50mL空白液的殘?jiān)|(zhì)量,g;1.2———鉻皮粉加入稀釋水的倍數(shù);0.075———鉻皮粉空白試驗(yàn)的容許修正值,g/L;m———試樣的質(zhì)量,g;X2———試樣的水分含量,%。(3)單寧酸的含量。單寧含量(X4)以干基計(jì),用百分?jǐn)?shù)表示,按(3)式進(jìn)行計(jì)算。1.3.2工作溶液的制備(1)稱取烘至恒重的標(biāo)準(zhǔn)單寧酸0.1g(稱準(zhǔn)至0.0001g),溶于少量60~70℃的蒸餾水中,移入100mL容量瓶,冷卻,定容。吸取1mL移入100mL容量瓶,定容,即為標(biāo)準(zhǔn)單寧酸工作溶液。(2)稱取烘至恒重的試樣約0.1g(稱準(zhǔn)至0.0001g),溶于少量60~70℃的蒸餾水中,移入100mL容量瓶?jī)?nèi),冷卻,定容,得試樣溶液。吸取該試樣溶液1mL移入100mL容量瓶,定容,得試樣工作溶液。(3)吸取試樣溶液20mL于250mL干燥的廣口瓶中,加入0.4g鉻皮粉,振蕩10min,用中速濾紙過濾,吸取1mL濾液移入100mL容量瓶,定容,得非單寧工作溶液。(4)用紫外分光光度計(jì)在276nm處,以蒸餾水為參比,用1cm石英比色皿分別測(cè)定各工作溶液的吸光度,按(4)式計(jì)算試樣的單寧酸含量,以干基質(zhì)量百分?jǐn)?shù)X2計(jì)算:式中,A0———試樣工作溶液的吸光度數(shù)值;A1———單寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品工作溶液的吸光度數(shù)值;A2———試樣中非單寧工作溶液的吸光度數(shù)值;m0———試樣質(zhì)量,g;m1———單寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量,g;X1———試樣干燥失重的數(shù)值,%。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取單寧酸對(duì)照品100.0mg,用水溶解并定容至100mL,用0.45μm濾膜過濾即得濃度為1.0mg/mL的單寧酸對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液的制備:同紫外分光光度法,用0.45μm濾膜過濾備測(cè)。(3)色譜條件:色譜柱為EclipseXDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),以甲醇-水-磷酸(85∶15∶0.070)為流動(dòng)相,流速0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)275nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量2μl。在該條件下,標(biāo)樣和五倍子樣品色譜圖見圖1。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:取對(duì)照品溶液(1.0mg/mL)適量,分別稀釋成100,200,300,400,500,600,700,800μg/mL的溶液,以峰面積A為縱坐標(biāo),樣品濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算,得回歸方程為:A=12.864C-69.181,r=0.9999。1.4ssr單次給藥后產(chǎn)品總安全量測(cè)定數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)每個(gè)產(chǎn)地的樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果間的差<1.5%,取算術(shù)平均值為單寧含量。不同方法測(cè)定結(jié)果的比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)和S-N-K多重比較及K-S正態(tài)性檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.13不同方法的結(jié)果2.1.1比例對(duì)不確定量表的影響不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為61.59%~68.30%,平均值為64.49%±2.31%(表1)。14個(gè)產(chǎn)地角倍樣品測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差為0.02%~1.22%,平均標(biāo)準(zhǔn)差0.48%,其中有2個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差大于1%,分別為1.09%和1.22%,其余12個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1%,表明皮粉法的測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定,重復(fù)性好。2.1.2皮粉法或c不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為60.48%~69.95%,平均值為64.63%±2.59%(表1),單寧含量的變異范圍較皮粉法大。14個(gè)產(chǎn)地角倍樣品測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差為0.21%~1.34%,平均標(biāo)準(zhǔn)差0.74%,其中有4個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差大于1%,分別為1.00%、1.19%、1.27%和1.34%,其余8個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1%,表明紫外分光光度法較皮粉法靈敏,穩(wěn)定性較皮粉法差。2.1.3紫外分光光度法與hplc法的比較不同產(chǎn)地的角倍單寧酸含量為60.51%~69.98%,平均值為66.03%±2.75%(表1),單寧含量的變異范圍較皮粉法大,與紫外分光光度法基本一致。14個(gè)產(chǎn)地角倍樣品測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差為0.22%~1.45%,平均標(biāo)準(zhǔn)差0.81%,其中有5個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差大于1%,變異為1.08%~1.45%,其余7個(gè)產(chǎn)地的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1%,表明HPLC法較皮粉法靈敏,穩(wěn)定性較皮粉法差,與紫外分光光度法基本一致。單因素方差分析(One-wayANOVA)及S-N-K多重比較分析結(jié)果:皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法測(cè)定的臺(tái)江、峨眉、永定和西鄉(xiāng)的單寧含量差異不顯著;其余10個(gè)產(chǎn)地的單寧含量差異顯著,其中湄潭、印江、桑植和古丈4個(gè)產(chǎn)地中,3種方法的測(cè)定結(jié)果均有顯著差異,并以HPLC法測(cè)定值最高,紫外分光光度法測(cè)定值次之(湄潭除外),皮粉法測(cè)定值最低(表1)。表明HPLC法的靈敏度較紫外分光光度法和皮粉法高。2.23測(cè)量結(jié)果和誤差K-S正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明(表2):皮粉法、紫外分光光度法、HPLC法的Z值分別為0.53,0.37和0.66,雙側(cè)P值分別為0.94,0.99和0.78,均大于0.05,表明3種方法的測(cè)量結(jié)果均遵從正態(tài)分布,測(cè)定誤差來源于隨機(jī)誤差。單因素方差分析(One-wayANOVA)結(jié)果:F=1.544,P=0.226>0.05(表3),表明3種方法的測(cè)量結(jié)果差異不顯著,即這3種方法均可用于五倍子單寧酸含量的測(cè)定。2.33測(cè)定時(shí)間和成本對(duì)3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜合比較(表4),皮粉法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高,測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,成本低,但測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),步驟繁瑣,需要較多的樣品量;紫外分光光度法的設(shè)備要求及測(cè)定成本中等,需要的樣品量少,但測(cè)定結(jié)果易受外界環(huán)境條件變化和雜質(zhì)的影響;HPLC法方便快捷,需要的樣品量極少,靈敏度高,但測(cè)定設(shè)備昂貴,成本高。因此,在五倍子單寧酸含量測(cè)定中可根據(jù)試驗(yàn)要求和設(shè)備條件選擇使用。3種方法的測(cè)量結(jié)果比較對(duì)皮粉法、紫外分光光度法、高效液相色譜法的測(cè)量結(jié)果分別進(jìn)行均數(shù)比較、正態(tài)檢驗(yàn)和方差分析(F檢驗(yàn))。正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果,3種方法的測(cè)量結(jié)果均呈正態(tài)分布,表明測(cè)定誤差來源于隨機(jī)誤差。F檢驗(yàn)結(jié)果,3種方法的測(cè)量結(jié)果差異不顯著,即3種方法均可用于五倍子單寧酸含量的測(cè)定。皮粉法是國(guó)際制革化學(xué)家協(xié)會(huì)從多種建議