分子生物學(xué)論文microRNA

MiRNA與人類(lèi)腫瘤關(guān)系摘要：microRNA又稱(chēng)miRNA,是真核生物細(xì)胞中固有的一類(lèi)不編碼蛋白的小分子RNA。生物體中,miRNA能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá),影響著幾乎所有的信號(hào)通路,參與多種生理病理過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。研究miRNA與腫瘤的關(guān)系是近年來(lái)備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一,其影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制將為腫瘤的診斷和治療提供新的思路。關(guān)鍵詞：微小RNA;腫瘤;基因調(diào)控;靶基因1.miRNA的介紹1.1miRNA的發(fā)現(xiàn)1993年,LeeRC等[2]在秀麗新小桿線蟲(chóng)(c.elegans)中意外地發(fā)現(xiàn)了一種定時(shí)調(diào)控胚胎后期發(fā)育的RNA,它是一種非編碼RNA,長(zhǎng)度為22nt，稱(chēng)為miRNA-lin4。2000年,miRNA-let7的發(fā)現(xiàn)掀起了尋找miRNA的熱潮。近幾年,隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,分子克隆技術(shù)的改進(jìn)和模式物種cDNA文庫(kù)的建立,相繼又在線蟲(chóng)、果蠅、Hela細(xì)胞等許多真核模式生物和細(xì)胞中找到了數(shù)百種相似的小分子RNA,并將其稱(chēng)為miRNA(microRNA)。自從1993年發(fā)現(xiàn)了首個(gè)miRNA以來(lái)，miRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)了眾多的細(xì)胞功能與發(fā)育過(guò)程。這一小分子連續(xù)幾年被國(guó)際分子生物學(xué)頂級(jí)雜志評(píng)為“十大科技突破之一”，也成為遺傳、發(fā)育、癌癥、干細(xì)胞等多個(gè)領(lǐng)域中的研究新熱點(diǎn)。時(shí)至今日，已有約1000個(gè)動(dòng)物的miRNA被報(bào)道，且約30%的基因被預(yù)測(cè)為miRNA的靶基因，能夠被miRNA所直接調(diào)控。1.2miRNA的特點(diǎn)MiRNA廣泛存在于真核生物中,是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA,它本身不具有開(kāi)放閱讀框架(ORF);通常的長(zhǎng)度為20～24nt,但在3′端可以有1～2個(gè)堿基的長(zhǎng)度變化;成熟的miRNA5′端有一磷酸基團(tuán),3′端為羥基,這一特點(diǎn)使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA的降解片段區(qū)別開(kāi)來(lái)；多數(shù)miRNA還具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。1.3miRNA的生成及成熟過(guò)程體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA的生成至少需要兩個(gè)步驟： 1）由長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前體（pre-miRNA)，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核;2)將pre-miRNA加工為成熟miRNA，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)。其具體過(guò)程為：miRNA基因在核內(nèi)由RNA聚合酶II(polII)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大的具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA。RNA–GTP和exportin5將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過(guò)堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)。2.miRNA與腫瘤的關(guān)系在過(guò)去10年里，隨著癌癥的分子分類(lèi)學(xué)方法的發(fā)展，我們?nèi)〉昧嗽S多成績(jī)[3]，尤其是在22000種蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，mRNAs被用于人類(lèi)多種癌癥的分類(lèi)。最近，發(fā)現(xiàn)了許多個(gè)小的非編碼miRNAs[4]。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNAs是秀麗隱桿線蟲(chóng)基因lin-4andlet-7的產(chǎn)物，它在控制生物周期中起重要作用，并很有可能調(diào)控mRNA的翻譯[5～7]。當(dāng)lin-4或let-7被滅活，特種上皮細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行額外分裂而非正常分化。因?yàn)楫惓＜?xì)胞增殖是癌癥的標(biāo)志，那么miRNA表達(dá)模式就有可能指示出腫瘤的惡性狀態(tài)。事實(shí)上，在一些類(lèi)型的腫瘤中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些miRNA表達(dá)的改變[8～11]。最近的研究確實(shí)發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)（fragilesite）。這說(shuō)明miRNAs在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用類(lèi)似于抑癌基因和癌基因的功能。2.1miRNA的分類(lèi)2.1.1充當(dāng)抑癌基因的MiRNAmir-125b-1，位于染色體的11q24脆性位點(diǎn)，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中11q924位點(diǎn)常有缺失，而這一位點(diǎn)并不存在已知的抑癌基因。且65%B細(xì)胞慢性淋巴型白血?。–LL）病人，50%的套細(xì)胞淋巴瘤病人，16-40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13q14位點(diǎn)的缺失。因此，在這個(gè)30Kb的區(qū)域中必定有一個(gè)腫瘤抑制基因的存在。而mir-15a和mir-16-1位于這一區(qū)域中一個(gè)功能未知的被稱(chēng)為L(zhǎng)EU2的非編碼蛋白的RNA基因的內(nèi)含子區(qū)域。Climmino等最近報(bào)道，miR-15a和miR-16-1負(fù)調(diào)控BCL2，一個(gè)抗凋亡基因，因此，這兩個(gè)miRNAs的缺失或下調(diào)，導(dǎo)致了BCL2表達(dá)的升高，促進(jìn)了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的發(fā)生。還有研究報(bào)道，mir-143和mir-145在結(jié)腸癌中明顯下調(diào)。有趣的是，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表明，可能是由于其成熟過(guò)程受到破壞。mir-143和mir-145的腫瘤抑制基因功能不僅僅局限于結(jié)腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細(xì)胞系中其表達(dá)量也明顯下調(diào)。此外，Takamizawa等發(fā)現(xiàn)肺癌與let-7表達(dá)顯著降低有關(guān)，會(huì)這導(dǎo)致這些病人預(yù)后更差。2.1.2充當(dāng)癌基因作用的miRNAmiR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加。這個(gè)基因在腫瘤組織中表達(dá)量比正常組織高5-100倍。反義核酸的研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)miRNA通過(guò)抑制凋亡而并非影響細(xì)胞增殖控制細(xì)胞生長(zhǎng)，這預(yù)示著這個(gè)miRNA具有癌基因的功能。由于mir-21不是一個(gè)大腦特異性的基因，在乳腺癌樣品中表達(dá)也有增加，這個(gè)基因可能在腫瘤發(fā)生中起到廣泛的作用。Metzler等人發(fā)現(xiàn)，在BIC基因上具有一段138個(gè)核苷酸的保守序列，編碼mir-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該研究組還發(fā)現(xiàn)在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表達(dá)量上升了100倍，此外的研究也發(fā)現(xiàn)，Hodgkin淋巴瘤等腫瘤中miR-155水平也有提高。因此，mir-155可能是作為一個(gè)癌基因和MYC協(xié)同作用，而其正常功能是在B細(xì)胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些對(duì)抗MYC信號(hào)通路的基因。He等人發(fā)現(xiàn)在散布的B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤中常常與13q31位點(diǎn)的擴(kuò)增有關(guān)。而在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌等實(shí)體瘤中，miR-155高表達(dá)，預(yù)示預(yù)后不良。miR-155在急性髓性白血病M4、M5型中、慢性淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)增加。Nikiforava等檢測(cè)甲狀腺癌的乳頭狀型、濾泡狀癌型、末分化癌型中，miR-155表達(dá)分別上調(diào)9.5、5.5、13.2倍。2.2因此，miRNA與腫瘤細(xì)胞的分化、與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡以及腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移有很大的關(guān)系2.2.1miRNA與腫瘤細(xì)胞的分化細(xì)胞分化是受基因高度精細(xì)調(diào)控的過(guò)程。EisPS等[12]發(fā)現(xiàn)編碼lin-28蛋白的mRNA3'UTR和let-7a、miR-125b以及miR-218的堿基互補(bǔ)配對(duì),而lin-28蛋白在胚胎癌性細(xì)胞和NT2/D1神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平逐漸下降,與此同時(shí),let-7a,miR-125b和miR-218在胚胎癌性細(xì)胞和NT2/D1神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平逐漸升高。這提示,編碼lin-28蛋白的mRNA可能是let-7a,miR-125b和miR-218的靶mRNA。let-7a,miR-125b和miR-218可能通過(guò)調(diào)節(jié)lin-28Mrnade表達(dá)控制NT2/D1神經(jīng)細(xì)胞分化和發(fā)育。2.2.2miRNA與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖、凋亡和分化失衡的結(jié)果。研究顯示,miRNA既可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,又可以抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。EisPS等[12]在B細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn),在各種類(lèi)型的B細(xì)胞淋巴瘤組織miR-155的表達(dá)較正常組織高10～30倍,而惡性程度高、預(yù)后較差、彌散性大的B細(xì)胞淋巴瘤miR-155增高尤為顯著。miR-21在人類(lèi)惡性膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),抑制miR-21的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加,而與凋亡密切相關(guān)的胱酰蛋白酶-3和胱酰蛋白酶-7活性增加了3倍[13]。miRNA不但可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,而且可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在肺癌組織和肺癌A549細(xì)胞中,let-7表達(dá)均顯著降低,將let-7a和let-7f轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中,細(xì)胞增殖受抑制,而且let-7f的抑制作用更為顯著[14]。2.2.3miRNA與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一。miRNA不僅參與腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程,在侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也具有重要作用。YuSL等[15]研究發(fā)現(xiàn),miR-137,182,372能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲,miR-221能夠抑制細(xì)胞的侵襲。ZhuS等[16]發(fā)現(xiàn),mir-21在轉(zhuǎn)移型乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞中,將轉(zhuǎn)染anti-mir-21在MDA-MB-231細(xì)胞注入年輕的雌性裸鼠體內(nèi)后,與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的裸鼠每個(gè)肺中的轉(zhuǎn)移灶(22個(gè))相比較,注有anti-mir-21細(xì)胞的小鼠的肺中轉(zhuǎn)移灶(2個(gè))顯著降低,而且這種抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控PDCD4和maspin來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3.面臨的挑戰(zhàn)3.1如何尋找miRNA分子信息學(xué)的方法：應(yīng)用計(jì)算機(jī)的方法如MirScan來(lái)尋找miRNA分子在線蟲(chóng)及脊椎動(dòng)物體內(nèi)取得了巨大的成功。驗(yàn)證miRNA在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，目前常用來(lái)檢測(cè)miRNA的技術(shù)主要有以下幾種：Northern雜交;原位雜交;Stem-loop實(shí)時(shí)定量RTPCR。這三種技術(shù)各有利弊，可以相互結(jié)合應(yīng)用，來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)miRNA的真實(shí)表達(dá)水平。3.2如何尋找miRNA作用的靶細(xì)胞MIT的BartelandChrisBurge報(bào)道了一種可以用來(lái)探測(cè)miRNA與其作用的靶基因之間關(guān)系的新的計(jì)算機(jī)方法—TatgetScan。他們針對(duì)已知的每一個(gè)miRNA，掃描mRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)——DNA轉(zhuǎn)譯為蛋白的生化信息，搜索與miRNA匹配的片段，然后對(duì)miRNA與mRNA的匹配程度評(píng)分，推測(cè)在三個(gè)或以上物種中獲得高分的mRNA為該miRNA的靶基因。3.3如何分離miRNA分子我們可以利用分子信息學(xué)篩選miRNA，其原理是：出發(fā)點(diǎn)為miRNA前體的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)及miRNA在物種間的保守性。miRNA基因可能定位于編碼蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域（有意義鏈或反意義鏈）及遠(yuǎn)離任何已知基因的基因間區(qū)域。有時(shí)幾個(gè)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)以多順?lè)醋拥男问絽布谝黄?提高尋找miRNA基因準(zhǔn)確性的一些附加條件：1）上游和下游保守序列的數(shù)量；2）候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守模序的存在。4.展望雖然,人類(lèi)對(duì)miRNA的研究在腫瘤學(xué)領(lǐng)域已取得一些進(jìn)展,但僅是冰山一角,仍需深入與廣泛研究。miRNA與腫瘤關(guān)系的研究目前還面臨很多問(wèn)題。首先,miRNA的加工過(guò)程復(fù)雜有序并且受多種因素精密調(diào)控。迄今為止,盡管已初步明確了miRNA的加工過(guò)程中的某些重要步驟,但其中具體的調(diào)控因素還不盡清楚。其次,miRNA存在時(shí)空表達(dá)特異性,不同類(lèi)型腫瘤、同一類(lèi)型腫瘤的不同階段miRNA表達(dá)存在高度時(shí)空特異性,還有待研究。最后,最新研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),與以往miRNA調(diào)控靶基因的作用機(jī)制不同,miRNA也可以作用于靶mRNA的5'-UTR而促進(jìn)該基因的翻譯[17-18]。還有報(bào)道表明,miRNA還可以作用于靶mRNA的蛋白編碼區(qū)抑制該基因的翻譯[19]。因此,miRNA調(diào)控靶基因的作用機(jī)制比以往的更為廣泛而復(fù)雜。現(xiàn)在的技術(shù)日新月異，相信新技術(shù)的發(fā)展必將為腫瘤學(xué)的研究,腫瘤的診斷和治療掀開(kāi)嶄新的篇章。參考文獻(xiàn)[2]LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.[3]LeeY,AhnC,HanJ,etal.ThenuclearRNaseIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing[J].Nature,2003,425(6956):415-419.[4]BernsteinE,CaudyAA,HammondSM,etal.RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference[J].Nature,2001,409(6818):363-366.[5]SchwarzDS,HutvágnerG,DuT,etal.AsymmetryintheassemblyoftheRNAienzymecomplex[J].Cell,2003,115(2):199-208.[6]KhvorovaA,ReynoldsA,JayasenaSD,etal.FunctionalsiRNAsandmiRNAsexhibitstrandbias[J].Cell,2003,115(2):209-216.[7]LiuJ,CarmellMA,RivasFV,etal.Argonaute2isthecatalyticengineofmammalianRNAi[J].Science,2004,305(5689):1437-1441.[8]SongJJ,SmithSK,HannonGJ,etal.CrystalstructureofArgonauteanditsimplicationsforRISCsliceractivity[J].Science,2004,305(5689):1434-1437.[9]NeilsonJR,ZhengGX,BurgeCB,etal.DynamicregulationofmiRNAexpressioninorderedstagesofcellulardevelopment[J].GenesDev,2007,21(5):578-589.[10]AsonB,DarnellDK,WittbrodtB,etal.DifferencesinvertebratemicroRNAexpression[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(39):14385-14389.[11]LeeRC,AmbrosV.AnextensiveclassofsmallRNAsinCaenorhabditiselegans[J].Science,2001,294(5543):862-864.[12]EisPS,TamW,SunL,etal.AccumulationofmiR-155andBICRNAinhumanBcelllymphomas[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(10):3627-32.[13]ChanJA,KrichevskyAM,KosikKS.MicroRNA-21isanantiapoptoticfactorinhumanglioblastomacells[J].CancerRes,2005,65(14):6029-6033.[14]TakamizawaJ,KonishiH,YanagisawaK,etal.Reducedexpressionofthelet-7microRNAsinhumanlungcancersinassociationwithshortenedpostoperativesurvival[J].CancerRes,2004,64(11):3753-3756.[15]YuSL,Ch