離子色譜法測(cè)定兩種不同寄主植物和粉虱蜜露中糖和氨基酸的比較

離子色譜法測(cè)定兩種不同寄主植物和粉虱蜜露中糖和氨基酸的比較

在尋找天敵行為時(shí)，是否正確定位主人和獵物取決于使用的信息的可靠性和可驗(yàn)證性，這是毋庸置疑的。最可靠的信息來(lái)自主客體本身。目前的研究普遍認(rèn)為,與寄主有關(guān)的化學(xué)信息(如寄主誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物、寄主利它素)和物理信息(如寄主的形狀、大小等)對(duì)天敵的寄主尋找和定位行為起著非常重要的引誘和導(dǎo)向作用(Dicke,1994;婁永根和程家安,1997;TurlingsandBenrey,1998),天敵往往能通過(guò)識(shí)別這些信息的特異性差異,找到適宜的寄主或獵物。利它素(kairomone)是指由某種生物個(gè)體釋放并引起它種個(gè)體行為反應(yīng)、對(duì)釋放者不利而對(duì)接受者有利的化學(xué)物質(zhì)(Vinson,1984;VetandDicke,1992)。寄生蜂利用多種信息尋找和識(shí)別寄主,寄主本身產(chǎn)生的化學(xué)信息物質(zhì)利它素就是其中一種重要線索(閻鳳鳴,2003)。昆蟲(chóng)蜜露作為一種利它素,通?？杀患纳蕴鞌澈筒妒承蕴鞌乘?對(duì)天敵的存活、產(chǎn)卵和脂肪體儲(chǔ)備以及天敵的寄主搜索行為和寄生/捕食效率具有增效作用(W?ckers,2000;陸宴輝等,2005),從而引起了人們對(duì)其組分和功能研究的興趣。煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)和溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum(Westwood)均是重要的多食性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),可危害蔬菜作物、經(jīng)濟(jì)作物與糧食作物,導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(TsuedaandTsuchida,1998)。尤其是B型煙粉虱,它是近二十年來(lái)入侵世界各國(guó)并暴發(fā)成災(zāi)的一種世界性重要害蟲(chóng)(張芝利,2000;褚棟等,2004)。自上世紀(jì)90年代中后期侵入中國(guó)以來(lái),該蟲(chóng)已迅速擴(kuò)散并在許多地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)(陳連根,1997;羅晨等,2000;趙莉等,2000)。麗蚜小蜂EncarsiaformosaGahan(Hymenoptera:Aphelinidae)是控制煙粉虱和溫室白粉虱若蟲(chóng)期的重要寄生性天敵(Hoddleetal.,1998;張世澤等,2003),前人的研究結(jié)果顯示,麗蚜小蜂取食煙粉虱蜜露有利于延長(zhǎng)壽命和促進(jìn)卵子的發(fā)生和成熟(Burgeretal.,2004);接觸蜜露或蜜露的存在可導(dǎo)致麗蚜小蜂的停留時(shí)間增加,進(jìn)而增強(qiáng)麗蚜小蜂的搜索能力,提高發(fā)現(xiàn)寄主的概率(vanRoermundandvanLenteren,1995;vanLenterenetal.,1996;RomeisandZebitz,1997)。本研究旨在進(jìn)一步針對(duì)B型煙粉虱和溫室白粉虱蜜露,比較分析其接觸性利它素和揮發(fā)性利它素組分,以期為粉虱天敵的寄主尋找和定位行為機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1溫室糯米粉保鮮劑B型煙粉虱采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,實(shí)驗(yàn)期分別在黃瓜Cucumissativus和甘藍(lán)Brassicapekinensis上飼養(yǎng);溫室白粉虱來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院品資所溫室,以黃瓜為寄主進(jìn)行飼養(yǎng)。甘藍(lán)品種為京豐1號(hào),番茄品種為中蔬5號(hào),黃瓜品種為中農(nóng)21號(hào),種子均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。所有試蟲(chóng)均分別在溫室內(nèi)隔離飼養(yǎng),溫室條件:光周期14L∶10D,光照強(qiáng)度>1000lx,溫度25±3℃,相對(duì)濕度60%～80%。1.2樣本的來(lái)源和預(yù)處理1.2.1煙粉病毒液的制備參考Byrne和Miller(1990)以及Byrne等(2003)的方法,分別同時(shí)收集6～8葉期黃瓜苗上的煙粉虱和白粉虱蜜露,以及6～8葉期的甘藍(lán)苗上的煙粉虱蜜露。即分別在受害的寄主植物葉片下放置一張鋁箔紙,放置時(shí)間為48h,分別收集相應(yīng)的寄主植物葉片上滴落的粉虱蜜露露斑,經(jīng)過(guò)稱量,再用去離子水沖洗,其洗脫液再用玻璃纖維濾紙進(jìn)行過(guò)濾以去除其中的雜質(zhì)。其水溶液再進(jìn)行冷凍干燥法去除水分,并通過(guò)添加去離子水最終分別配成0.02g/mL的樣品溶液,置于冰箱中保存?zhèn)溆?。進(jìn)樣前分別稀釋100、1000和10000倍,然后進(jìn)行離子色譜儀分離測(cè)定。取樣重復(fù)3次。1.2.2提取樣品和濃縮樣品采用1.2.1節(jié)的方法分別收集甘藍(lán)上B型煙粉虱蜜露和黃瓜上溫室白粉虱蜜露蜜斑各0.1g于2mL的玻璃樣品瓶中,然后注入1.5mL的二氯甲烷封閉1h,將用移液管改進(jìn)過(guò)的吸附管插入樣品瓶瓶口,調(diào)整旋轉(zhuǎn)使之接觸處有良好的封閉性,微熱讓二氯甲烷帶著樣品提取物質(zhì)只經(jīng)吸附管通過(guò),從而達(dá)到被吸附目的。吸附管內(nèi)裝150mgSuper-Q吸附劑(美國(guó)色譜科Supleco公司),待樣品瓶中二氯甲烷揮發(fā)完畢,再用1mL的二氯甲烷洗脫吸附管濃縮樣品至0.2mL后置于-20℃冰箱備用。取樣重復(fù)3次。1.3測(cè)定寄生蟲(chóng)蜜露中糖和氨基酸的組成和含量的方法1.3.1無(wú)水醋酸鈉鹽酸鈉氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,生化級(jí)標(biāo)準(zhǔn),上?？颠_(dá)生物制品有限公司。葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、水蘇糖、海藻糖、巖藻糖、棉子糖和松二糖標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司。無(wú)水醋酸鈉(AAA-DirectCertified,Dionex,P/N05932)。氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純,>99%),氨水(25%,分析純),鹽酸(36%,優(yōu)級(jí)純),甲酸(88%,分析純),疊氮化鈉,均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。StyreneDVB003x7強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(直徑0.3～0.4mm,交換容量為1.8mmol/mL)。1.3.2全巖色譜-質(zhì)譜條件GS50四元梯度泵,帶在線脫氣;ED50A電化學(xué)檢測(cè)器(金工作電極,pH/Ag/AgCl參比電極,鈦對(duì)電極);AS50自動(dòng)進(jìn)樣器(進(jìn)樣體積25mL);LC30柱溫箱(30℃);Chromeleon6.5色譜工作站;超純水設(shè)備(Barnstead,IA,美國(guó)):中國(guó)科學(xué)院生態(tài)中心提供。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HP5890,MS5972):中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中日農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心公共實(shí)驗(yàn)室提供。電子天平(Sartorius,Bp211D,德國(guó))。1.3.3柱溫控制和保護(hù)柱氨基酸的分離使用DionexAminoPacPA10陰離子交換柱,包括分析柱(250mm×2mmi.d.)和保護(hù)柱(40mm×2mmi.d.)。柱溫控制為30℃。色譜流路的A通道為水,B通道為250mmol/LNaOH淋洗液,C通道為1mol/L的NaAc淋洗液。淋洗液流速為0.25mL/min。進(jìn)樣體積設(shè)定為25mL,采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量定性分析。1.4進(jìn)樣及進(jìn)樣條件采用GC-MS對(duì)兩種粉虱蜜露和若蟲(chóng)揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析。分析條件為:HP5890工作站,毛細(xì)管柱為極性柱DB-5MS(膜厚0.25μm,長(zhǎng)30m,內(nèi)徑0.25mm)。氣譜條件:進(jìn)樣口溫度230℃,不分流進(jìn)樣。連接口溫度180℃,程序升溫,45℃保持3min,每分鐘升溫5℃,至230℃,保留5min。氦氣流速為1cm/s。每次進(jìn)樣1μL。采用標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)照的方法對(duì)化學(xué)組分進(jìn)行定性,用揮發(fā)物峰面積進(jìn)行相對(duì)定量和比較。2結(jié)果與分析2.1不同種類(lèi)粉保糖組分的組分組成和含量從表1可以看出:(1)粉虱蜜露中含有豐富的糖和氨基酸,單糖主要有葡萄糖和果糖,二糖有蔗糖異構(gòu)糖、松二糖、麥芽糖和蔗糖,三糖有松三糖和棉子糖,四糖有水蘇糖;主要氨基酸有甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺。總體而言,蜜露中糖含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。甘藍(lán)上B型煙粉虱蜜露、黃瓜上B型煙粉虱蜜露和黃瓜上溫室白粉虱蜜露中糖的含量分別是相應(yīng)氨基酸含量的42.5、2.6和5.4倍;其中糖類(lèi)物質(zhì)中又以寡糖含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),分別占糖類(lèi)物質(zhì)的89.3%、81.7%和88.2%。(2)不同的寄主植物顯著影響粉虱蜜露中糖和氨基酸的組成和含量:甘藍(lán)上煙粉虱蜜露與黃瓜上煙粉虱和白粉虱蜜露中的單糖(如葡萄糖和果糖)含量盡管組成比例有差異,但單糖總糖含量差異不大,分別為10.41%、13.17%和9.96%。甘藍(lán)上煙粉虱蜜露中的寡糖以二糖占優(yōu)勢(shì),占寡糖總量的97.25%;二糖中又以蔗糖異構(gòu)糖和松二糖占優(yōu)勢(shì),分別占二糖含量的54.18%和36.41%。甘藍(lán)上煙粉虱蜜露中的主要二糖蔗糖異構(gòu)糖、松二糖和麥芽糖顯著大于黃瓜上煙粉虱和白粉虱蜜露中的相應(yīng)含量,其中前者的蔗糖異構(gòu)糖和麥芽糖分別是后兩者的8.0和3.9倍及23.1和1.8倍;且后兩者均未檢測(cè)到松二糖;而其他一些二糖含量則表現(xiàn)為前者顯著低于后者。黃瓜上煙粉虱蜜露和白粉虱蜜露以三糖和四糖占優(yōu)勢(shì),分別占寡糖總量的73.07%和85.44%;其中黃瓜上煙粉虱蜜露和白粉虱蜜露中的優(yōu)勢(shì)糖水蘇(四)糖和松三糖分別占三糖和四糖總量的55.19%和35.86%及58.47%和31.57%;黃瓜上煙粉虱蜜露和白粉虱蜜露中松三糖的含量分別是甘藍(lán)上煙粉虱蜜露中含量的5.3倍和10.1倍,而棉子糖和水蘇糖均未在甘藍(lán)上的煙粉虱蜜露中檢測(cè)到。甘藍(lán)上煙粉虱蜜露中的氨基酸含量均顯著低于黃瓜上煙粉虱和白粉虱蜜露中相應(yīng)含量;其中甘氨酸在前者未檢測(cè)到,而在后二者中含量最高,分別占氨基酸總量的38.2%和51.7%;甘藍(lán)煙粉虱蜜露中氨基酸以丙氨酸占優(yōu)勢(shì),占氨基酸總量的66.5%。(3)同種寄主植物上不同粉虱種類(lèi)的蜜露組成和含量也存在差異:就單糖而言,黃瓜上溫室白粉虱蜜露中單糖總量稍大于煙粉虱;黃瓜上煙粉虱蜜露和白粉虱蜜露中二糖總量差異不大,但單糖組成比例梯度存在差異,其中優(yōu)勢(shì)糖類(lèi)蔗糖異構(gòu)糖為前者大于后者,而蔗糖和麥芽糖為后者大于前者;白粉虱蜜露中的三糖和四糖含量均顯著大于煙粉虱蜜露中的含量,其中前者中松三糖、棉子糖和水蘇糖分別是后者的1.9、2.4和2.3倍;黃瓜上煙粉虱蜜露中氨基酸總量明顯大于溫室白粉虱蜜露,但谷氨酰胺和甘氨酸含量為后者大于前者,而丙氨酸、纈氨酸和絲氨酸含量則為前者大于后者。綜合分析顯示,影響粉虱蜜露中糖分和氨基酸組成和含量的因素總體表現(xiàn)為寄主植物的作用大于粉虱種類(lèi)造成的影響。2.2揮發(fā)性化合物類(lèi)型在甘藍(lán)上的B型煙粉虱蜜露中共檢測(cè)到3種揮發(fā)性化合物(圖1),分別為鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(分子式:C24H38O4;保留時(shí)間:36.35)、十四(烷)酸(分子式:C14H28O2;保留時(shí)間:34.90)和二十六烷(C26H54;保留時(shí)間44.12),其中十四(烷)酸通過(guò)與對(duì)照比對(duì)為甘藍(lán)葉片的揮發(fā)性化合物。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯的相對(duì)含量最高,峰面積百分比為88.2%。在黃瓜上的溫室白粉虱蜜露中僅檢測(cè)到一種揮發(fā)物,即鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(圖2),與在甘藍(lán)上的B型煙粉虱蜜露中檢測(cè)到的化合物為共有化合物。3不同寄主植物對(duì)蜜露組分及氨基酸組分組成的影響昆蟲(chóng)蜜露的利它作用,一是由于蜜露中富含大量的接觸性利它素,如糖、氨基酸和微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可被一些天敵昆蟲(chóng)用作補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)以提高其壽命和繁殖力(EnglandandEvans,1997;Eijsetal.,1998)。本研究結(jié)果顯示不同寄主植物上2種粉虱蜜露均富含糖類(lèi)物質(zhì)和氨基酸,由此推斷這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能對(duì)粉虱天敵的壽命和卵子發(fā)生起到了補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的作用,但具體是蜜露中何種組分起主要作用及其作用機(jī)理尚需深入研究。二是由于蜜露通常與寄主存在位置有很大的相關(guān)性,蜜露作為天敵的食物源和利它素源暗示著天敵對(duì)食物的搜索可能對(duì)寄主的搜索起到了重要的補(bǔ)充作用(W?ckers,2000)。關(guān)于蜜露對(duì)天敵具有近距離引誘作用的行為研究較多,但由于揮發(fā)性物質(zhì)含量甚微,對(duì)其揮發(fā)物組分的分析和鑒定的研究較少(WickremasingheandvanEmden,1992)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種粉虱蜜露中均含有鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯,且不受粉虱種類(lèi)和寄主植物的影響,該物質(zhì)可能在粉虱天敵的寄主搜索和食物尋找行為中起重要的導(dǎo)向作用。由于蜜露中營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)天敵的利它作用,從而引起了人們對(duì)其利它組分、組分的產(chǎn)生及功能的深入探究。Hendrix等(1992)在比較研究3種粉虱和4種蚜蟲(chóng)蜜露中的糖分組成時(shí)發(fā)現(xiàn),其糖分組成受寄主植物和昆蟲(chóng)的種類(lèi)共同決定,但昆蟲(chóng)的種類(lèi)差異所起的作用更大;Byrne等(2003)在比較不同的同翅目昆蟲(chóng)蜜露中蔗糖異構(gòu)糖和其他寡糖含量時(shí)也得到類(lèi)似的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同的寄主植物和粉虱種類(lèi)顯著影響蜜露中糖和氨基酸的組分和含量,尤其是影響寡糖和氨基酸的組成,且寄主植物的影響要大于粉虱不同種類(lèi)對(duì)蜜露組成的影響,如甘藍(lán)上B型煙粉虱蜜露中的寡糖以二糖占優(yōu)勢(shì),而黃瓜上B型煙粉虱蜜露和溫室白粉虱蜜露寡糖中以三糖和四糖占優(yōu)勢(shì)。這可能受黃瓜韌皮部汁液初始糖分組成的影響。另外,Byrne和Miller(1990)發(fā)現(xiàn),取食一品紅Euphorbiapulcherrima和南瓜Cucurbitaargyrosperma葉片的煙粉虱蜜露中糖和氨基酸種類(lèi)和含量比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果多,而糖種類(lèi)比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果少,這可能與不同寄主植物以及檢測(cè)儀器設(shè)備等因素有關(guān)。另外,盡管寄生蜂和捕食者能利用蜜露的事實(shí)已經(jīng)被反復(fù)驗(yàn)證并被普遍接受,但從進(jìn)化角度來(lái)看,蜜露對(duì)它的產(chǎn)生者(刺吸性昆蟲(chóng))本身就代表了潛在適合度成本(fitnesscosts),這些成本可能對(duì)刺吸性昆蟲(chóng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的選擇壓以促使他們改變蜜露組成(W?ckersandSwaans,1993)。如Byrne和Miller(1990)發(fā)現(xiàn),煙粉虱在攝取植物韌皮部汁液過(guò)程中能自身合成一些寡糖和特定的氨基酸,如取食一品紅和南瓜的煙粉虱蜜露中優(yōu)勢(shì)糖為蔗糖異構(gòu)糖,但該糖在兩種寄主植物韌皮部中均不存在;一品紅和南瓜韌皮部均不含有的6種氨基酸在煙粉虱2個(gè)品系的蜜露中卻含量豐富。本研究結(jié)果還顯示,受寄主植物南瓜和粉虱種類(lèi)的影響,在甘藍(lán)上煙粉虱蜜露中以二糖蔗糖異構(gòu)糖和松二糖占優(yōu)勢(shì)(47.1%和31.6%),但黃瓜上煙粉虱蜜露和白粉虱蜜露中蔗糖異構(gòu)糖含量均相對(duì)較低(9.7%和2.0%),且未檢測(cè)到松二糖;黃瓜上煙粉虱蜜露和溫室白粉虱蜜露中水蘇(四)糖和松三糖含量豐富,分別占糖含量的33.0%和21.4%及44.1%和23.8%,而在甘藍(lán)上B型煙粉虱蜜露中松三糖含量較低,且未檢測(cè)到水蘇糖的存在。同樣,在其他研究結(jié)論中,也發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)蜜露中的寡糖受寄主植物和昆蟲(chóng)種類(lèi)共同決定(Hendrixetal.,1992;Byrneetal.,2003),同種植食者在不同寄主植物上的蜜露糖分組成亦顯著不同(FischerandShingleton,2001)。由于刺吸性昆蟲(chóng)能自身合成特定的寡糖和氨基酸并在昆蟲(chóng)蜜露中豐富存在,誘發(fā)了人們對(duì)昆蟲(chóng)合成型糖和合成型氨基酸功能的探究。目前研究聚焦在蔗糖異構(gòu)糖和松三糖,因?yàn)檎崽钱悩?gòu)糖是大多數(shù)粉虱,尤其是煙粉虱蜜露中的主要糖分(Byrneetal.,2003),而松三糖是昆蟲(chóng)蜜露中最普遍含有的昆蟲(chóng)合成糖(W?ckers,2000),這兩種寡糖也是本實(shí)驗(yàn)三種粉虱蜜露中的主要糖分。目前的證據(jù)表明,粉虱蜜露中蔗糖異構(gòu)糖的產(chǎn)生和粉虱體內(nèi)的內(nèi)生菌的存在有很強(qiáng)的聯(lián)系(Davidsonetal.,1994,2000)。盡管許多因素(如內(nèi)生菌、溫度、光強(qiáng)、成蟲(chóng)種群密度、昆蟲(chóng)年齡和昆蟲(chóng)發(fā)育階段等)影響粉虱蜜露中蔗糖異構(gòu)糖的含量(Henneberryetal.,1999),但最重要的影響因子為食物中蔗糖濃度,蔗糖異構(gòu)糖是從蔗糖