深層次了解免疫共沉淀

一、免疫共沉淀實驗免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。區(qū)別于IP實驗，CO-IP與IP只取決于檢測焦點是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）二實驗過程1、 提取蛋白。2、 在細胞裂解液中加入抗乂的抗體。3、 孵育后再加入ProteinA或G（于Agarose或magneticbeads等介質(zhì)上）。若細胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復合物：“Y—X一抗X抗體一ProteinA或G"4、 經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。（xy抗原、x抗體）。5、 westernblot分析，質(zhì)譜分析。三CO-IP特征優(yōu)點：1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響。3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。局限性：1、 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用2、 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；3、 必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果四、 實驗的關(guān)鍵1、 實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。2、 為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。3、 考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。4、 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。五、 注意的問題：1、 裂解液（1） 、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100）。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。（2） 、不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS），細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，2、 免疫沉淀中抗體的選擇單克隆抗體群（由一個免疫原產(chǎn)多克■抗體 單克■抗體生的多個單克隆抗體混合物

抗體抗原信號強度極佳由抗體的親和力決定極佳特異性通常較好，但有時會有非特異性作用極佳，但有時會有交義反應特異性好，親和力高優(yōu)點親和力高（抗體可以和多個抗原決定簇結(jié)合）特異性好特異性好，親和力高缺點非特異性作用很難去除需要篩選親和力高的抗體，抗原表位是否被相互作用蛋白遮敝決定極佳或較弱能夠篩選得到的符合條件的單克隆并不多，免疫沉淀效果極佳由抗體親和力決定極佳免疫共沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性由抗體的親和力決定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮敝決定極佳染色質(zhì)免疫沉淀效果通常很好，但有時非特異性相互作用會帶來假陽性由抗體的親和力決定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮敝決定極佳3、抗體使用對照抗體：（陰性和陽性）

陰性：單克隆抗體：同一種屬的igG兔多克隆抗體：正常兔IgG陽性：細胞內(nèi)某種蛋白的抗體(做膜蛋白A,用膜蛋白B)4.、未檢測到目得蛋白或蛋白很少原因解決方案樣品被蛋白酶降解添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4C以下冰上操作并防止凍融抗體濃度太低：調(diào)整抗體濃度，必要時設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度抗抗體親合力太低選用適合于IP和/或IB的相應抗體IP抗體未與珠子結(jié)合選用適合于IP的相應珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面改變tag融合表達部位裂解液嚴謹度太高改用低嚴謹度裂解液5、目得蛋白高背景非特異蛋白結(jié)合(1)在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞；(2)在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子預洗，(3)免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴謹度(高鹽或去垢劑)裂解液嚴謹度太低改用高嚴謹度裂解液實驗儀器或液體被污染使用潔凈的儀器或液體轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面

1!機(asnoiu)i!>|asequoiin|osg/v\ZZ6sqe1!機(liqqej)ii>|asequoiin|osg/v\9乙6sqe6iu-[961asno|/\|8￡00乙sqe6ujoiD^IIjqqeyS￡00乙sqeWdSIAId9i7l6sqes^sa^oS理岫dFD/dD蛔并）齡SS6s