elisa技術(shù)操作條件的探討

elisa技術(shù)操作條件的探討

酶聯(lián)免疫試劑盒是一種常見(jiàn)的藥物殘留檢測(cè)方法。與機(jī)器分析技術(shù)相比，具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈活性好等特點(diǎn)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作條件的要求比較嚴(yán)格。實(shí)驗(yàn)條件主要由實(shí)驗(yàn)室的操作環(huán)境和操作人員的操作熟練程度兩方面組成,但ELISA試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)境的要求是幾種藥物殘留檢測(cè)方法中相對(duì)較低的。由于大部分的試驗(yàn)操作步驟都是由實(shí)驗(yàn)人員來(lái)完成的,人為的誤差相對(duì)嚴(yán)重一些。本人結(jié)合幾年的工作實(shí)踐介紹一下進(jìn)行ELISA操作的時(shí)候應(yīng)該注意的問(wèn)題。1一般規(guī)則以及酶免疫試劑盒的操作1.1水不穩(wěn)定加樣器208080200.2m天平進(jìn)行確定(由于蒸餾水不含雜質(zhì),溫度環(huán)境為20℃左右時(shí),1mL的水可以看作是1g、200μL的水可以看作是0.2g)每一把微量加樣器都應(yīng)該將其最高量程和最低量程進(jìn)行確定。1.2使用微樣品裝置時(shí)，在不同的瓶子中收集液體后，更換槍頭，即使吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液1.3吸收液體時(shí)，速度不容易迅速，不會(huì)產(chǎn)生氣泡，吸收量不正確1.4自然流下去使槍頭上的液滴和孔壁接觸,液滴會(huì)自然流下去。吸入液體時(shí)的最好的方法是吸兩檔打一檔,防止由于槍頭的毛細(xì)作用使得部分液體不能流出而造成的誤差。1.5在吸收液體時(shí)，應(yīng)選擇與實(shí)際劑量接近的微量吸樣器，以減少誤差1.6所有液體都添加到酶標(biāo)孔中，因此酶標(biāo)板應(yīng)放在桌子上行輕輕搖晃30s,使液體充分混合均勻,也使其得到充分的反應(yīng)。1.7在孵育過(guò)程中，應(yīng)將覆蓋層膜關(guān)閉，以防止水分蒸發(fā)，并避免線性曲線1.8在考試前30分鐘內(nèi)，從冰箱中取出所有測(cè)試試劑，并測(cè)試劑盒中的所有試劑與提取好的樣品溶液的溫度相同,酶標(biāo)板只要取出所需量。1.9由于表面的顯色劑對(duì)光和敏感，因此應(yīng)將其保持干燥1.10在手動(dòng)清潔板的過(guò)程中，每次添加清潔溶液。將其設(shè)置為15.30秒，否則就沒(méi)有將一個(gè)酶標(biāo)孔中的洗滌液濺入另一酶標(biāo)孔中,防止交叉污染。甩去洗滌液后將酶標(biāo)板放在毛巾或吸水紙上拍干。1.11在檢測(cè)吸收之前，打開(kāi)酶標(biāo)儀，并在30分鐘以上的溫度下烘干1.12底部材料為tsb，避免接觸皮膚。最終溶液為2mol的濃硫酸具有耐腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸皮膚1.13喂食時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒和手冊(cè)的規(guī)定進(jìn)行1.14我們應(yīng)該盡量多地進(jìn)行雙孔實(shí)驗(yàn)，不僅確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，而且反映實(shí)驗(yàn)盒的一致性1.15如果樣品的結(jié)果可疑，應(yīng)使用其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證1.16沒(méi)有去離子水或雙蒸水時(shí),可以使用娃哈哈純凈水配制溶液,切勿使用自來(lái)水。2使用試劑盒時(shí)的問(wèn)題解決2.1加標(biāo)回溫、孵育溫度不高時(shí)，試劑盒的內(nèi)容物沒(méi)有充可能引起的原因有試劑盒已過(guò)有效期、使用的試劑盒內(nèi)容物不是同一個(gè)批次的、沒(méi)加入酶標(biāo)記物、試劑盒的內(nèi)容物沒(méi)有充分的回溫、孵育的溫度太低等,相對(duì)應(yīng)的解決辦法是更換成在有效期以內(nèi)的試劑盒、使用同一個(gè)批次的試劑盒的內(nèi)容物、按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行操作、將試劑盒的內(nèi)容物充分的回溫后再進(jìn)行操作、在實(shí)驗(yàn)操作的整個(gè)過(guò)程中請(qǐng)仔細(xì)觀察恒溫箱的溫度。2.2孔間加入試樣量的控制可能引起的原因有酶標(biāo)板孔間相互污染、洗板后未能盡快進(jìn)行下一步操作、添加樣品或其它試劑時(shí)操作的方法不對(duì)、孵育位置避光性不佳或蓋板膜沒(méi)有密封好使得水分蒸發(fā)、酶標(biāo)板孔間加入的試劑量不同,相對(duì)應(yīng)的解決辦法是加樣時(shí)請(qǐng)小心勿將液體濺入另一孔中,人工洗板時(shí)也請(qǐng)小心,勿將洗滌液濺入另一微孔中、在洗板后及時(shí)進(jìn)行下一步操作、添加試劑時(shí)請(qǐng)懸空滴入,切記勿將槍頭接觸到板孔內(nèi),吸取不同試劑瓶中的液體時(shí)就要更換一次槍頭、確認(rèn)孵育環(huán)境不透光,蓋板膜將酶標(biāo)板密封好、使用已校正過(guò)的微量加樣器,如將第一次加入液體時(shí)槍頭上留有一滴的液體滴下,那么將以后槍頭上留有的液體也滴下,以保證加入液體體積的一致性。2.3延長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)度可能引起的原因有孵育的溫度過(guò)高、反應(yīng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。相對(duì)應(yīng)的解決辦法是調(diào)整孵育環(huán)境的溫度,如無(wú)法調(diào)整室內(nèi)的溫度,請(qǐng)將顯色時(shí)間適當(dāng)?shù)目s短、控制反應(yīng)時(shí)間。2.4試劑未充分的混