抗磷脂抗體綜合征患者血清中識別纖溶酶、抗凝血酶和活性蛋白c的檢測

抗磷脂抗體綜合征患者血清中識別纖溶酶、抗凝血酶和活性蛋白c的檢測

抗磷脂抗體（apl）是抗磷脂抗體綜合征（aps）的重要血清學特征。臨床研究表明，aPL與APS的臨床表現(xiàn)如反復的動、靜脈血栓、多發(fā)性流產(chǎn)、血小板減少癥等癥狀相關。近年我們及其他研究者的研究結(jié)果表明，aPL是一組異質(zhì)性自身抗體，而不是單一的自身抗體,其所針對的靶抗原可為磷脂、纖溶酶/纖溶酶原、β2GP1(β2-glycoprotein1，β2糖蛋白1)、凝血酶/凝血酶原和蛋白C(activateproteinc,APC)等凝血過程相關因子。基于aPL與凝血酶和纖溶酶的親和力要高于aPL與凝血酶原和纖溶酶原的親和力,本研究建立了抗纖溶酶、凝血酶和活性蛋白的檢測方法并初步探討其臨床意義。材料和方法一、診斷及鑒別標準血清標本來自門診及住院患者。共選擇了40例APS患者血清,其中原發(fā)性APS9例，繼發(fā)性APS31例,包括28例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE),2例干燥綜合征，1例狼瘡樣疾病。SLE的診斷符合美國風濕病學會1982年制訂的SLE分類的修訂標準。APS的診斷參照有關標準。血栓的診斷依據(jù)相關的臨床表現(xiàn)及血管造影、CT、MRI等檢查。與研究組年齡與性別相匹配的40份健康人血清作為對照組。二、單克隆抗體hrp-羊抗人igg纖溶酶（heamatologicaltechnologies,EssexjunctionVT）溶于PBS5μg/ml,50μl/孔包被反應板(highbindingplates,Costar,Cambrige),4℃過夜,用含0.25%明膠的PBS緩沖液封閉37℃1.5h,pH7.4PBS洗板,2min/次×3,加入1∶300稀釋的待檢血清（用含0.1%明膠PBS緩沖液稀釋）,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,分別加入稀釋的酶標抗體HRP-羊抗人IgG,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,加入底物TMB顯色,450nm測A值。用人單克隆抗體IS61μg/ml為陽性對照。陽性結(jié)果判定:當樣品的A值大于陰性對照均值加3s以上時為陽性。三、酶標抗體的篩選凝血酶（heamatologicaltechnologies,EssexjunctionVT）溶于PBS5μg/ml,50μl/孔包被反應板，4℃過夜,用含0.25%明膠的PBS緩沖液封閉37℃1.5h,pH7.4PBS洗板,2min/次×3,加入1∶100稀釋的待檢血清（用含0.1%明膠的PBS緩沖液稀釋）,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,分別加入稀釋的酶標抗體HRP-羊抗人IgG,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,加入底物TMB顯色,450nm測A值。用人單克隆抗體IS61μg/ml作為陽性對照。陽性結(jié)果判定:當樣品的A值大于陰性對照均值加3s以上時為陽性。四、抗apc抗體試驗結(jié)果一、aps組與p7例抗體檢測結(jié)果比較APS組和對照組血清抗纖溶酶抗體的檢測結(jié)果見圖1，兩組樣本抗體檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗差異有顯著性（P<0.01,t檢驗），如以對照組A值的均值+3s為標準，APS組有17例陽性（17/40,42.5%）。二、aps組與對照組a值及其他指標檢測結(jié)果比較APS組和對照組血清的抗凝血酶抗體的檢測結(jié)果見圖2，兩組樣本檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗差異有顯著性（P<0.01,t檢驗），如以對照組A值的均值+3s為標準，APS組14例陽性（14/40,35%）。三、抗apc抗體測定APS組和對照組血清的抗APC抗體的檢測結(jié)果見圖3，兩組樣本檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗差異無顯著性（P>0.05,t檢驗）。aps患者血清中抗凝血酶的活性變化臨床檢測aPL的方法有抗心磷脂抗體(anticardiolipinantibody,aCL)ELISA檢測法和狼瘡抗凝因子等方法,其中以aCL-ELISA方法最常用,且已標準化。常規(guī)aCL-ELISA法所檢測的抗體可能包括:(1)直接與心磷脂結(jié)合的抗體,其與感染有關,稱之為不依賴于β2GP1的aCL(β2GP1-independentaCL);(2)針對β2GP1的抗體,稱為β2GP1依賴性aCL(β2GP1-dependentaCL);(3)近年來發(fā)現(xiàn)aCL可識別與磷脂結(jié)合的其他血漿蛋白(phospholipid-bindingprotein),如凝血酶原、蛋白S、蛋白C等。我們用EB病毒轉(zhuǎn)化APS患者外周血淋巴細胞，篩選出8株人單克隆aCL，其中6株可同時識別凝血酶/凝血酶原、纖溶酶/纖溶酶原、APC/蛋白C和β2GP1。此研究結(jié)果表明這些抗原間存在共同抗原表位，對這些抗原的氨基酸序列和3D結(jié)構的分析亦支持上述結(jié)論。另外，aCL與纖溶酶的親和力可達3×108M,高于aCL與纖溶酶原的親和力約103M。體外實驗證明，aCL可抑制纖溶酶對纖維蛋白的降解作用而促進血栓形成。同樣，aCL與抗凝血酶的親和力亦高于其與凝血酶原的親和力。aCL體外可通過抑制抗凝血酶酶Ⅲ對凝血酶的滅活而促進血栓形成。另外，aCL體外可抑制蛋白C的負反饋調(diào)節(jié)途徑。所以從理論上可推測，檢測患者抗凝血酶、抗纖溶酶和抗APC自身抗體可能比檢測抗凝血酶原、抗纖溶酶原和抗PC自身抗體有更高的臨床價值。為研究APS患者血清中是否存在抗凝血酶、抗纖溶酶和抗APC自身抗體，本研究建立了相應的檢測方法，檢測40例APS和40名正常健康者對照血清。從圖1可以看出，兩組樣本抗纖溶酶抗體檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗差異有顯著性，如以對照組A值的均值+3s為標準，APS組有17例抗纖溶酶抗體陽性（17/40,42.5%）,而對照組均為陰性。從圖2可以看出，兩組樣本抗凝血酶抗體的檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗亦差異有顯著性，如以對照組A值的均值+3s為標準，APS組有14例抗凝血酶抗體陽性（14/40,35%）。而40名對照組樣本均為陰性。從圖3可以看出，兩組樣本抗APC抗體檢測結(jié)果的A值經(jīng)檢驗差異無顯著性，表明APS和正常組血清均存在抗APC抗體。我們的初步研究結(jié)果表明，APS患者的血清中存在抗凝血酶、抗纖溶酶和抗APC自身抗體，驗證了先前aCL單抗的研究結(jié)果。但有關這些自身抗體的特異性及其對患者發(fā)生血栓的預測價值有待進一步研究。另外，從aPL對凝血系統(tǒng)影響的體外研究結(jié)果推測，僅有一部分aPL具致病性(如CL15樣的aPL，可同時與凝血酶、纖溶酶和蛋白C結(jié)合，并可抑制其功能)。所以建立能檢測CL15樣aPL的方法并研究其臨床意義將是今后的重要課題。APC(heamatologicaltechnologies,Essexjunc-tionVT)5μg/ml溶于TBS緩沖液（20nmol/LTrisHcl,150nmol/LNaCl,2.5nmol/LCaCl2,pH7.4,),50μl/孔包被反應板，4℃過夜,用含0.3%明膠的TBS緩沖液封閉37℃2h,TBS洗板,2min/次×3,加入1∶100稀釋的待檢血清（用含0.1%明膠的