乙型肝炎病毒抗原的研究進(jìn)展

乙型肝炎病毒抗原的研究進(jìn)展

與hbv相關(guān)的抗炎病毒最初是在澳大利亞的土著人血清中發(fā)現(xiàn)的，后來被稱為澳大利亞抗炎毒癥。根據(jù)其他研究，乙型肝炎病毒是一個球形顆粒，相當(dāng)于過去發(fā)現(xiàn)的dane。與hbv相關(guān)的顆粒有三種：大球形、小球形和管狀，這些是dna病毒之一。人體感染肝炎病毒后，血清中可能存在三種不同的抗炎反應(yīng)系統(tǒng)。乙型肝炎表面抗原抗體(HBsAg-HBsAb)系統(tǒng),乙型肝炎表面抗原有數(shù)種抗原決定簇,組成抗原A和D、Y、W、R四個亞型抗原。因此,HBsAg有四種亞型adw、adr、ayr、ayw。由于世界地區(qū)分布不同,所含亞型不同,我國及日本、北美、北歐及太平洋地區(qū)以AD為主,非洲和澳大利亞及地中海以AY多見,而希臘以AY為主。乙型肝炎核心抗原、抗體(HBcAg-HBcAb)系統(tǒng),乙型肝炎核心抗原存在于乙型肝炎病毒的核心部分,免疫電鏡和熒光標(biāo)記技術(shù)證明,它定位于受染肝細(xì)胞的核內(nèi),而HBsAg則生成肝細(xì)胞漿中,由此推斷,在血清不能檢測到核心抗原(HBcAg),但能檢測到核心抗體。乙型肝炎e抗原、抗體(HBeAg-HBeAb)系統(tǒng)。e抗原是一種可溶性蛋白,它有e1、e2兩部分,關(guān)于e抗原的本質(zhì)尚無定論,但公認(rèn)e抗原與病毒復(fù)制有關(guān),它可能是受病毒感染肝細(xì)胞所合成的一種宿主抗原,HBeAg只能在HBsAg陽性患者血清中檢出。隨著人們對HBV給人體造成損害的認(rèn)識的不斷提高,各國學(xué)者為了弄清HBV致病機(jī)制、HBV基因結(jié)果和檢測方法的研究進(jìn)行了不懈的努力。檢測方法的不斷改進(jìn),也促進(jìn)了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的飛速發(fā)展,乙肝病毒抗原的檢測由最開始的瓊脂免疫擴(kuò)散、對流電泳、間接血凝、反向間接血凝試驗(yàn)到如今的ELISA(酶免)技術(shù)、放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)以及PCR技術(shù)等。檢測方法更加靈敏、簡便、快捷、微量,結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,特別是PCR技術(shù)的應(yīng)用于臨床,檢測技術(shù)更是一個從量到質(zhì)的飛躍?？芍苯訖z測人體內(nèi)HBV的有無及在體內(nèi)的含量,同時可監(jiān)測治療效果,但目前開展PCR技術(shù)受諸多因素的影響,一般實(shí)驗(yàn)室開展有一定的困難,而酶免方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏可靠,血中含量≥1ng/ml就能檢測出。所以,作為乙肝兩對半檢測,酶免方法為更多醫(yī)院所首選。乙肝兩對半的檢測,現(xiàn)已成為各大、小醫(yī)院常規(guī)的檢測項目,甚至包括一些鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院及個體診所。由于它的檢測方法靈敏、簡便、快捷、微量、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,并且可以人工判讀結(jié)果,不需要特殊的儀器及設(shè)備,所以,對如何保證乙肝兩對半檢測的質(zhì)量,使其具有較高的重復(fù)性、準(zhǔn)確性和各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果有可比性,就有必要對乙肝兩對半的試劑及在乙肝兩對半檢測過程中,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各個環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。在這里談?wù)剛€人看法(主要針對ELISA法),與檢驗(yàn)同道共同磋商。在乙肝兩對半的檢測過程中,要保證乙肝兩對半的檢測質(zhì)量,應(yīng)注意從以下幾方面進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。1室內(nèi)環(huán)境質(zhì)量控制1.1各種試劑的選用試劑是保證乙肝兩對半檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的最關(guān)鍵的環(huán)節(jié),試劑質(zhì)量的好壞,直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。雖然各醫(yī)院使用的試劑都是各個生物制品廠生產(chǎn)的成套試劑,但由于各生物制品廠生產(chǎn)的成套試劑靈敏度(有1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml)和特異性有所不同,要保證乙肝兩對半檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,在使用過程中不要經(jīng)常更換廠家,選擇一個信譽(yù)較高的廠家(知名廠家所生產(chǎn)的試劑盒是通過嚴(yán)格的檢測,經(jīng)過各大醫(yī)院長期使用所確認(rèn)),無論是重復(fù)性,還是準(zhǔn)確性都較高,所檢測的結(jié)果各實(shí)驗(yàn)室之間可比性、準(zhǔn)確率和可靠性都較高。1.2檢驗(yàn)儀質(zhì)量監(jiān)測直接向臨檢中心購買,乙肝兩對半檢測一般是一個定性試驗(yàn),檢測過程中使用參考品(一般用臨界值血清作質(zhì)控物),一是對試劑盒進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測,二是對檢驗(yàn)的整個過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測,避免假陰、假陽性,并在每次實(shí)驗(yàn)時,必須同時作陰、陽性對照(一些條件較差的鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院及個體診所,為了節(jié)約成本往往省略不做),以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2按說明書加樣血清標(biāo)本應(yīng)盡量避免溶血和細(xì)菌污染,以防過氧化物酶樣物質(zhì)造成的假陽性。標(biāo)本應(yīng)新鮮,40℃保存不宜超過5d,以免因標(biāo)本中的IgG聚合導(dǎo)致本底加深,影響結(jié)果判斷。注意從以下幾方面進(jìn)行質(zhì)量控制。加樣量的準(zhǔn)確與否,直接關(guān)系到結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,要保證加樣量的準(zhǔn)確性,必須要有一個加樣準(zhǔn)確的加樣器(多數(shù)醫(yī)院使用的是帶彈簧的加樣器),加樣器有一個缺點(diǎn),使用一定時間,或放置不當(dāng),或因生銹,彈簧失去一定彈性,均影響加樣量的準(zhǔn)確性,所以,每隔一定時間進(jìn)行校正,以保證加樣量的準(zhǔn)確性。由于各生物制品廠生產(chǎn)的成套試劑盒均使用滴瓶,但滴瓶的口徑各廠家也不太一致,雖然按使用說明書操作,每一滴相當(dāng)于50μl加樣量,但存在一定的誤差,并且每個操作人員在滴液過程中,使用的角度不可能完全相同,因此,加樣的多少也就不同,檢測的結(jié)果存在誤差也就較大,為保證檢驗(yàn)質(zhì)量及結(jié)果的準(zhǔn)確性,建議各種試劑(包括陰、陽性血清、酶、底物、顯色劑、終止液)加樣前,充分混勻后,使用加樣器進(jìn)行加樣。為了保證乙肝兩對半檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,建議最好是一次性使用,但現(xiàn)在許多醫(yī)院所使用的吸頭都不是一次使用,大多反復(fù)多次使用,甚至一些條件差的鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院或個體診所,為了節(jié)約成本,一頭多用(即用一個吸頭將所有樣品加完)。大家知道,一個高滴度的乙肝攜帶者的血清樣本有時稀釋成千上萬倍后,檢測結(jié)果仍然顯陽性,如果吸頭未沖洗干凈,則可能造成下次標(biāo)本出現(xiàn)假陽性結(jié)果。特別是一頭多用,如果前一個患者是一個高滴度的乙肝攜帶者,吸頭的殘留液可能造成以后連續(xù)幾個樣品出現(xiàn)陽性,造成假陽性,使結(jié)果失真。如果條件有限,則必須將加樣頭用消毒液浸泡一定時間,反復(fù)沖洗后再煮沸消毒,烘干使用,使假陽性結(jié)果降到最低限度。嚴(yán)格按說明書加樣完成后,孵育及顯色時間、溫度應(yīng)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,孵育及顯色時間如果放置不夠,將可能造成假陰性結(jié)果(主要是低滴度的樣本),孵育溫度不能過高、過低,應(yīng)嚴(yán)格控制在37℃左右。過高,可能造成酶失活;過低,酶結(jié)合不充分,均可能造成假陰性結(jié)果。顯色時間不能過長,放置過久,結(jié)果判讀、比色時間應(yīng)在30min內(nèi)完成(大家知道,底物液和顯色劑作用時間過久,因受空氣中氧氣的氧化作用后,均可能要出現(xiàn)顏色反應(yīng)),否則,結(jié)果難以判斷,可能出現(xiàn)假陽性。2.4最大缺點(diǎn)—洗板在乙肝兩對半檢測過程中,洗板時間、次數(shù)是非常重要的一個質(zhì)量控制環(huán)節(jié),在大多數(shù)縣級以上醫(yī)院都已使用自動洗板機(jī)。使用自動洗板機(jī)在洗板過程中,要防止堵孔:①洗板機(jī)內(nèi)部結(jié)晶形成,特別是冬天,因此應(yīng)經(jīng)常對洗板機(jī)進(jìn)行內(nèi)部沖洗;②血漿纖維蛋白形成,在洗板過程中造成堵孔,洗板前對檢測樣品進(jìn)行檢查去除)。洗板完成后,有時仍有少量殘留液(一般少于2μl),應(yīng)在濾紙上充分拍干。酶標(biāo)條放在酶標(biāo)板上不要過高過低,避免洗板時吸液針卡板和吸液效果差,以保證檢驗(yàn)質(zhì)量。對多數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院及個體診所來說,由于條件的限制,仍使用手工洗板,手工洗板的最大缺點(diǎn)就是沖洗量、速度及時間不易控制。大家知道,乙肝兩對半檢測本身是一個微量反應(yīng)過程,沖洗不當(dāng)(如量過多外溢,污染相鄰樣品孔造成交叉污染)也將造成假陽性或假陰性結(jié)果,為了保證乙肝兩對半檢測質(zhì)量的準(zhǔn)確性和可靠性,必須按說明書嚴(yán)格操作,并制定嚴(yán)格的洗板操作規(guī)程,使本實(shí)驗(yàn)室工作人員不因個人意愿操作,造成檢驗(yàn)結(jié)果的不一致。應(yīng)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作,不能根據(jù)自己的愛好,隨意加大或減少配制濃度,洗滌液濃度過高,可能造成假陰性,洗滌液濃度過低,可能造成假陽性結(jié)果。每次使用完成后,加防塵罩,但由于在使用過程中,儀器的凈電吸引作用,可使空氣中的灰塵吸附在機(jī)器上,特別是附著在比色孔上,時間過久灰塵過多,光線不易通過濾光片,影響比色。所以,每隔一定時間要除塵,特別是比色孔。在我們平時的實(shí)驗(yàn)檢測過程中,做定性測定的時侯,有時會遇到某些樣品測得的OD值在Cutoff(臨界值)附近區(qū)域(即灰區(qū))可通過設(shè)定這個范圍來確定灰區(qū)的大小和判定結(jié)果?；覅^(qū)的大小是一個經(jīng)驗(yàn)值,設(shè)置范圍一般根據(jù)各地情況而定,一般設(shè)定在Cutoff(臨界值)附近±10%的區(qū)域,如果定性結(jié)果落在灰區(qū)中,可建議過一段時間再來復(fù)查,以保證本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。大家知道,酶容易失活,底物和顯色劑受溫度影響也較大,特別是在高溫情況下,更是如此,在鄉(xiāng)鎮(zhèn)及個體診所,由于標(biāo)本量較小,藥盒使用時間較長,在乙肝兩對半加樣完成后,應(yīng)立即將藥盒放回4℃～8℃冰箱保存,以盡量保證試劑質(zhì)量和延長使用時間。綜上所述,在乙肝兩對半檢測過程中,只要我們檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照試劑盒操作說明去做,在整個實(shí)驗(yàn)操作過程中,每一環(huán)節(jié)按照以上幾方面做好質(zhì)量控制