分解纖維素的微生物的分離專題省名師優(yōu)質(zhì)課賽課獲獎課件市賽課一等獎課件

分解纖維素微生物分離YNMZZXzjx第1頁㈠纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一個由葡萄糖首尾相連而成高分子化合物，是含量最豐富多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識

植物根、莖、葉等器官都含有大量纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高天然產(chǎn)物。第2頁土壤中一些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。第3頁纖維素是地球上含量最豐富多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生纖維素超出70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶微生物所利用，不會大量積累。在草食性動物等消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素能力。人類可應用分解纖維素微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。第4頁2.纖維素酶

纖維素酶是一個復合酶，普通認為它最少包含三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素第5頁①取二支20mL試管試驗：纖維素酶分解纖維素試驗②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管濾紙條消失

討論：乙試管濾紙條為何會消失？甲試管作用是什么？第6頁提醒：本試驗自變量是纖維素酶有沒有，自變量操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量緩沖液，不能加入蒸餾水，不然會影響溶液pH。試驗分析：P27小試驗是怎樣組成對照？第7頁剛果紅染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與水解后纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。

（二）纖維素分解菌篩選

當我們在含有纖維素培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素復合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心透明圈，這么我們就能夠經(jīng)過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第8頁第9頁二、實驗設(shè)計

請你依據(jù)試驗流程圖和提供三個資料以及“操作提醒”，在思索相關(guān)問題基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細試驗方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈菌落第10頁①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素環(huán)境中操作步驟生物與環(huán)境相互依存關(guān)系，在富含纖維素環(huán)境中纖維素分解菌含量相對提升，所以從這種土壤中取得目標微生物幾率要高于普通環(huán)境。②原因第11頁③實例：樹林中多年落葉形成腐殖土，多年積累枯枝敗葉等。④討論:假如找不到適當環(huán)境，能夠?qū)V紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存適宜環(huán)境。普通應將濾紙埋于深約10cm左右土壤中。第12頁2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要微生物。

①目標：②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)。第13頁培養(yǎng)基成份分析培養(yǎng)基組成提供主要營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水第14頁提醒：自變量為培養(yǎng)基種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。A、旁欄中配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為何？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養(yǎng)基對微生物是否含有選擇作用？假如含有，是怎樣進行選擇？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素微生物能夠大量繁殖。C、你能否設(shè)計一個對照試驗，說明選擇培養(yǎng)基作用第15頁

在選擇培養(yǎng)條件下，能夠使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件微生物得到快速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件微生物繁殖被抑制，所以能夠起到“濃縮”作用。為何選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需微生物？第16頁思索：本試驗流程與課題2中試驗流程有哪些異同？

本試驗流程與課題2流程區(qū)分以下。課題2是將土樣制成菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題經(jīng)過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在判別培養(yǎng)基上。其它步驟基本一致。第17頁按照課題1稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后培養(yǎng)基進行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋101102103104105106第18頁4.將樣品涂布到判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上（1）制備判別培養(yǎng)基:（2）涂布平板：將稀釋度為104～106菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。第19頁培養(yǎng)基組成提供主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素判別纖維素分解菌培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第20頁方法一：先

，再加入剛果紅進行顏色反應。方法二：在

時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板5.剛果紅染色法

挑選產(chǎn)生透明圈菌落，普通即為分解纖維素菌落。第21頁這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？染色法優(yōu)點缺點方法一方法二顏色反應基本上是纖維素分解菌作用1.操作繁瑣2.剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶微生物也產(chǎn)生含糊透明圈(假陽性反應)2.有些微生物能降解色素，形成顯著透明圈第22頁方法一中NaCl溶液作用？思索：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢剛果紅，以免出現(xiàn)透明圈不夠清楚。用這方法能夠判斷酶活力大小。實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基多糖底物，但分解纖維素細菌能夠產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這么剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就能夠使結(jié)合不牢剛果紅洗去，這么就留下大大小小透明圈，大透明圈當然分解纖維素能就強！第23頁比較項目分解尿素細菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目標鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細菌涂布在只有尿素做氮源選擇培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)第24頁比較項目分解尿素細菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型目標鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法在細菌分解尿素化學反應中，細菌合成脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基堿性增強，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅剛果紅能夠與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心透明圈觀察菌落周圍是否有著色環(huán)帶出現(xiàn)來判定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法第25頁

在產(chǎn)生顯著透明圈菌落，挑取并接種到纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可取得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)第26頁分解纖維素微生物分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理試驗設(shè)計土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色判別分離出分解菌課堂總結(jié)第27頁四、結(jié)果分析與評價