微流控芯片在細胞生物學研究中的應用

微流控芯片在細胞生物學研究中的應用

微流控制芯片也稱為芯片實驗室，是一種主要的科學研究，用于在微米尺度空間中控制水流。生物和化學等實驗室的基本功能可以微縮到幾厘米的芯片上。微流控芯片最早的表現(xiàn)形式是以單一分離為主的芯片電泳,此后的一段時間則著重發(fā)展顯示分析功能的微全分析系統(tǒng)。目前,微流控芯片研究的熱點正逐步轉(zhuǎn)向構(gòu)建各種不同類型的芯片實驗室,從化學、生物到信息、光學,林林總總,特別是以細胞生物學的系統(tǒng)研究為基本目標的微流控芯片細胞實驗室正呼之欲出。細胞是生命體結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位,細胞研究是生命科學研究的基礎,是現(xiàn)代生命科學發(fā)展的重要支柱。現(xiàn)階段,細胞生物學研究出現(xiàn)了以下幾種趨勢:(1)從結(jié)構(gòu)研究轉(zhuǎn)為生命活動研究;(2)從局部的單一研究轉(zhuǎn)為系統(tǒng)生物學研究;(3)從靜態(tài)研究轉(zhuǎn)為動態(tài)研究;4)從單學科的生物學研究轉(zhuǎn)為多學科的綜合研究。這樣一種變化迫使人們尋求一種與之相適應的平臺技術,微流控芯片技術的出現(xiàn)則適逢其時,越來越多的跡象表明微流控芯片技術將成為細胞研究的一個極為重要的平臺,究其原因不外乎下述幾點:(1)芯片微米尺度空間和細胞的尺寸恰恰相配;(2)芯片操作所需的細胞量很少,非常適合于來源稀缺但又十分重要的細胞研究,如原代細胞和干細胞等;(3)芯片的多維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)形成相對獨立、封閉的環(huán)境,與體內(nèi)環(huán)境類似;(4)芯片多種單元技術的靈活組合使集成化、系統(tǒng)化的細胞研究成為可能,諸如細胞種植、培養(yǎng)、刺激施加和熒光標記檢測等過程可在一塊芯片上完成;(5)芯片可以滿足高通量細胞分析的需要,同時獲取大量的生物學信息。本文以本課題組近年來的研究工作為基礎,結(jié)合其他實驗室的研究進展,從平臺及應用對象的特征著手,介紹微流控芯片細胞實驗室的發(fā)展概況。1流網(wǎng)微通道技術微流控芯片細胞實驗室可以看做是把細胞操作及控制等部件集成或基本集成到一塊幾平方厘米的芯片上,由微通道形成網(wǎng)絡,以可控流體貫穿整個系統(tǒng),用以實現(xiàn)常規(guī)細胞實驗室各種功能的一種科學技術平臺。它的基本特征和最大優(yōu)勢是多種單元技術的整體可控、靈活組合和規(guī)模集成。1.1流體控制部件微流控芯片細胞實驗室的單元部件通常分為細胞操作部件和流體控制部件兩大類。前者主要包括細胞培養(yǎng)、分選、裂解和檢測等單元,用于基本的細胞操作;后者則以微泵和微閥為主,用于操控微流體在不同的細胞操作部件之間的流動。1.1.1細胞操作系統(tǒng)微流控芯片細胞實驗室依托于不斷發(fā)展的微加工技術,已能構(gòu)建微米級且相對封閉的細胞培養(yǎng)、分選、裂解和檢測等操作部件。這種部件和傳統(tǒng)的操作部件相比優(yōu)勢明顯。傳統(tǒng)的細胞操作繁瑣,試劑耗量很大,特別是相對于細胞的微小尺寸,碩大的操作環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相差較遠,難以客觀真實地反映生理狀態(tài)下細胞的微環(huán)境特征。與之相反,微型化的細胞操作系統(tǒng)不僅大大減少了細胞和試劑的耗量,降低了成本,更可以方便地實現(xiàn)各細胞操作部件之間的耦聯(lián),特別有利于研究細胞和微環(huán)境的各種關系,研究系統(tǒng)和整體,因此有可能使常規(guī)細胞研究從理念到方法均產(chǎn)生根本性的變革。以對細胞運動的控制為例,可以利用傳統(tǒng)的多層光刻技術,制作出深、寬為數(shù)微米甚至幾百納米的各種“壩形”、“篩形”、“碗形”等微結(jié)構(gòu)以阻擋細胞,也可以用作者所在課題組采用的“液塑法”一次成型制作出多深度結(jié)構(gòu)的芯片。圖1所示即為用該方法制作的細胞捕獲芯片,其捕獲單元為“T”形流路,總體通道寬度為500μm,在“T”形交匯處有一段局部變窄的通道,其寬度為60~100μm,深度為10μm,形成芯片的細胞捕集區(qū)域。1.1.2微閥的組成微通道網(wǎng)絡中流體的驅(qū)動和控制技術是集成微流控芯片的運作基礎,微泵微閥是大規(guī)模集成微流控芯片實現(xiàn)流體操控的主要手段。微閥的分類方法有多種,按照激勵機構(gòu)的需要與否,可把微閥分成有源閥和無源閥兩類。無源閥不需要外部控制,利用流體本身流向和壓力的變化就可以實現(xiàn)閥狀態(tài)的改變,以雙晶體單向閥和凝膠閥為主要代表。有源閥也稱主動閥,通常是利用外界制動力來實現(xiàn)閥的開啟和關閉動作。它有多種制動原理,包括氣動、熱膨脹、壓電效應、形狀記憶合金、靜電和電磁等。把多個微閥組合,依次開、關,就構(gòu)成了微泵。作者所在課題組已研制出由169個微閥參與控制的芯片免疫系統(tǒng),并已將微泵微閥技術用于細胞和線蟲的操控。1.2玉米尺度的傳質(zhì)特性微流控芯片細胞實驗室中流體運動所遵循的力學法則大體上和宏觀自然界的固有定律一致,需要注意的只是從宏觀尺寸到微米尺寸轉(zhuǎn)化時所涉及的各種力的相對重要性和不同的力之間相互影響的變化。由于微米尺度遠大于通常意義上分子的平均自由程,一般認為連續(xù)介質(zhì)定理成立,連續(xù)性方程可用,電滲和電泳淌度與尺寸無關;但是在微米尺度下,面積與體積比顯著增加,黏性力、表面張力、換熱等表面作用增強,邊緣效應增大,慣性力影響減小,雷諾數(shù)變小(通常在10-6~101之間),傳質(zhì)過程從以對流為主轉(zhuǎn)為以擴散為主,層流特點明顯,三維效應不可忽略。這樣一種對超低雷諾數(shù)流體的操控是微流控芯片細胞實驗室的操作核心。1.2.1細胞接種、培養(yǎng)液交換微流控芯片細胞實驗室在進行細胞接種和培養(yǎng)液的交換時,多采用重力驅(qū)動流體,即在進樣口內(nèi)加入細胞或擬交換的培養(yǎng)液,使其液面高于出口處液面,在重力作用下,液體流入芯片微通道內(nèi),完成細胞接種或培養(yǎng)液交換。此法操作簡單,不需要專用設備,在微流控芯片細胞實驗室中廣泛應用。但是由于進、出口處的液面很快就達到平衡,液體流動速度逐漸減緩,最后停止,因此難以維持液體在微通道內(nèi)持續(xù)流動。1.2.2微量注射泵微流控芯片細胞實驗室的很多操作需要維持流體以恒定的速度在微通道內(nèi)流動,如細胞灌流培養(yǎng)、利用層流生成濃度梯度、形成液滴包裹細胞等。精密注射泵可以將流速控制在0.001~100μL/min,因此微量注射泵在微流控芯片細胞實驗室中廣泛使用。注射泵使用方法簡單,不要額外的控制系統(tǒng),適合于沒有微流控技術經(jīng)驗的生物醫(yī)學研究者。1.2.3利用微泵微閥實現(xiàn)動態(tài)細胞外在和內(nèi)與芯片尺寸相適應的微泵微閥的研究是微流控芯片發(fā)揮集成優(yōu)勢的關鍵。微泵微閥的使用不僅使我們有可能控制微通道內(nèi)流體的速度和方向,還可以通過和其他功能單元集成組合,完成更復雜的實驗操作。借助于芯片上的微泵微閥實現(xiàn)微通道中流體的操縱是當前大規(guī)模集成微流控芯片所采用的主要手段。Wu所在課題組設計了利用微泵驅(qū)動的高通量細胞三維灌流培養(yǎng)芯片,并成功地培養(yǎng)了口腔癌細胞。該課題組還利用微泵和微閥實現(xiàn)了細胞的分離及細胞裂解后核酸的收集。當然,微泵微閥增加了芯片制作的難度,并且需要特殊的操控系統(tǒng)。1.3功能部件組合微流控芯片的重要優(yōu)勢之一在于操作單元的規(guī)模集成,微流控芯片細胞實驗室所涉及的細胞培養(yǎng)、分選、裂解、內(nèi)涵物分析等功能部件按需求可靈活組合,這種組合的有效運行則借助于對系統(tǒng)中流體的整體控制。在本文中,我們把微流控芯片細胞實驗室的集成分為相同功能部件或部件群的簡單組合和不同功能部件或部件群的規(guī)模集成兩類。1.3.1細胞外激素類細胞培養(yǎng)是生物學研究的基本操作單元。Hung等設計了100×100陣列細胞培養(yǎng)池,對細胞進行灌流培養(yǎng),并將細胞培養(yǎng)單元與濃度梯度生成器相結(jié)合,同時施加10種濃度的藥物刺激。細胞分選是從大量非均一細胞群體中獲取某種特定細胞的一種技術,常用于細胞生物學和臨床醫(yī)學領域。Yun等設計了單細胞捕獲芯片,細胞在壓力作用下向前運動并被側(cè)通道的液流帶到捕獲單細胞的位置;單個細胞被捕獲在側(cè)通道口,阻止主通道液流向該方向流動,其余細胞則會被主通道液流帶至下一個細胞捕獲口,形成陣列單細胞捕獲。DiCarlo等設計的微陣列芯片,采用半滲透微結(jié)構(gòu),一旦單個細胞在微穴中定位,其他細胞將改變流動方向,進入別的微穴,形成單細胞陣列。1.3.2超聲材料和微流控芯片的作用機制作者所在課題組設計并制作了一種如圖2所示的三層立體藥物代謝研究微流控芯片,是在同一塊芯片上同時實現(xiàn)分子層面和細胞層面雙重分析的典型案例。該芯片集成了藥物代謝研究所需的功能單元,包括代謝物在線生成、檢測、細胞培養(yǎng)和藥物細胞毒效應評價,分別從分子和細胞水平驗證了苯妥英(PH)增強對乙酰氨基酚肝毒性的作用機制,顯示了該芯片系統(tǒng)潛在的應用前景。Taylor等將超聲儀整合到微流控芯片上,改進了超聲波發(fā)生器尖端和液體的接口,保證超聲波的能量可以連續(xù)、完全地傳遞到液體中,實現(xiàn)了細胞孢子的在線快速裂解,以及胞內(nèi)脫氧核糖核酸(DNA)的PCR(polymerasechainreaction)擴增和檢測。Waters等在PCR區(qū)域控制溫度為94℃,于4min內(nèi)實現(xiàn)了大腸桿菌熱裂解,并完成核酸的PCR擴增、電泳分離。Liu等在集成了泵閥、加熱器和DNA傳感器的芯片上實現(xiàn)了血液中病原性細菌熱裂解PCR反應和DNA雜交等過程。2微流控制芯片細胞實驗室的應用對象特征我們從細胞個體、細胞群體和多細胞生命體研究等三個方面概述微流控芯片細胞實驗室的應用對象特征。2.1關于細胞個體的研究2.1.1微流控芯片流式細胞儀檢測細胞分選是從大量非均一細胞群體中獲取某種特定細胞的一種技術,常用于細胞生物學和臨床醫(yī)學領域。目前常用的細胞分選技術以流式細胞儀(flowcytometry)為主,流式細胞儀設備昂貴、體積龐大、需要專人操作,且細胞用量很大(>104),難以在實驗室和醫(yī)院得到廣泛應用?；谖⒘骺匦酒牧魇椒诌x成本低廉,有可能實現(xiàn)儀器的小型化、集成化、自動化和便攜化[22,23,24,25,26,27,28]。一旦成熟,則可以克服現(xiàn)行商業(yè)儀器的兩種局限。Wlodkowic等成功地在微流控芯片平臺上開展了單個腫瘤細胞的凋亡分析,用于篩選抗腫瘤藥物。Bao等設計了微流控電穿孔流式細胞儀并用來研究單細胞的生物力學特性,其通量可達5個細胞/s。Lancaster等用CD4(clusterofdifferentiation4)熒光抗體標記白細胞,采用鞘流方式捕獲單個陽性細胞,細胞標記時間可以通過流速和微通道寬度控制,15s即可完成細胞標記,大大縮短了操作時間。2.1.2基于聚二甲基硅氧烷pdms的微流控芯片細胞內(nèi)涵物如某些蛋白質(zhì)在細胞中含量極低(小于1000個分子/細胞),但對于細胞功能的發(fā)揮卻起著至關重要的作用,現(xiàn)有方法往往難以在單細胞水平上對這類蛋白質(zhì)進行檢測。作者所在課題組建立了同時檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)的微流控芯片-激光誘導熒光法,并以三氧化二砷誘導急性早幼粒白血病細胞(NB4)凋亡為模型,實現(xiàn)了對凋亡NB4細胞中氧化還原狀態(tài)的監(jiān)測。為了能更精確地控制細胞裂解的位置,近來又將進樣器改為雙T形,在兩個T形交叉口間通過微加工形成一窄通道,這種芯片設計方式可使十二烷基硫酸鈉(SDS)充分接觸細胞膜表面,保證細胞能快速、有效裂解,并使細胞每次裂解的位置相同,有利于后續(xù)內(nèi)涵物分析結(jié)果在遷移時間上的重復性。本課題組還發(fā)現(xiàn),微通道表面經(jīng)過涂層修飾后電滲被完全抑制時,細胞在化學試劑作用下裂解的速度會大大提高,由此建立了一種基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的簡單、快速、高通量的單細胞內(nèi)小分子和核酸的分析方法。隨著人類基因組測序工作的完成,單細胞水平的基因調(diào)控研究已越來越被人們所重視,微流控芯片細胞實驗室也在此方面做了大量的工作[31,32,33,34,35,36,37,38]。Marcy等設計的微流控芯片成功地實現(xiàn)了單個大腸桿菌的分離及其基因組DNA擴增;Chen等設計的高通量微流控裝置可以在3h內(nèi)獲取50個神經(jīng)干細胞的互補DNA(cDNA);Bontoux等設計的微流控裝置成功地完成了對單個神經(jīng)元祖細胞的捕獲、裂解、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增。2.2關于細胞聚集的研究2.2.1料，級現(xiàn)有典型的芯片尺寸約為幾個平方厘米,操作單元的尺度在微米級。在如此小的芯片上進行實驗所需要的細胞的量通常在幾個~幾百個,大大減少了細胞的用量,適合于來源稀缺的細胞(如原代細胞和干細胞等)的研究。2.2.2微流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)細胞間的相互作用按照系統(tǒng)生物學的說法,生物系統(tǒng)被看成是一個整體,整體中包含有很多局部,這些局部之間有很多易于理解的生物化學網(wǎng)絡,而這些網(wǎng)絡又可以用數(shù)學模型定量表達,系統(tǒng)生物學主要通過分析系統(tǒng)中各局部組成之間的相互作用來研究其結(jié)構(gòu)、動力學的控制方法,并對由基因或環(huán)境引起的影響作出響應。換句話說,對于細胞、組織、器官這樣一些生命組成單元,人們不僅要確定它們的靜態(tài)組成,更重要的是要考慮各個單元、各種組成之間動態(tài)的相互聯(lián)系及相互作用。在哲學上,這被稱之為辯證。微流控芯片所具有的多維網(wǎng)絡系統(tǒng)為研究細胞間的相互作用提供了方便[39,40,41,42,43,44]。Chung等在微流控芯片平臺上實現(xiàn)了血管內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞的非接觸式共培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞遷移進入膠原蛋白基質(zhì)內(nèi)并形成管狀結(jié)構(gòu)。Sudo等以微流控芯片為平臺,實現(xiàn)了肝癌細胞與血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng),并同時對血管內(nèi)皮細胞施加持續(xù)的間隙流刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在三維基質(zhì)內(nèi)生成血管。作者所在課題組目前設計了一系列的細胞共培養(yǎng)微流控芯片,并進行細胞的二維及三維共培養(yǎng),用于研究細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的作用,力圖使體外細胞研究環(huán)境越來越接近體內(nèi)細胞環(huán)境。2.2.3等人源細胞生物學特性對移植細胞的影響細胞在體內(nèi)要經(jīng)歷生長、分化、凋亡等一系列生命活動。微流控芯片的集成化優(yōu)勢允許我們將細胞的整個生命活動集成到一塊芯片上來完成。Kintzios等設計的微型傳感器系統(tǒng)實時檢測細胞的分裂和死亡。Rowlands等在微流控芯片平臺上考察了基質(zhì)的硬度及粘附蛋白配體對人間充質(zhì)干細胞向成骨細胞和成肌細胞分化的影響,結(jié)果表明單純改變基質(zhì)的硬度不能影響干細胞分化。Chung等利用微流控芯片生成連續(xù)的濃度梯度,考察生長因子對干細胞分化的影響。腫瘤細胞作為一類變異的特殊細胞群體,其生命活動也有其特殊性,特別是侵襲性的生長方式等。芯片設計上的靈活性又使人們可以根據(jù)研究需要設計出特定的芯片,對腫瘤細胞侵襲周圍基質(zhì)進行考察。為研究腫瘤細胞在三維介質(zhì)中的遷移運動,作者所在課題組設計并制作了一種微流控芯片,通過注射泵在芯片上生成穩(wěn)定的細胞生長因子濃度梯度,進而研究了乳腺癌細胞MCF7在三維介質(zhì)中的活性和在趨化物誘導下的遷移運動(見圖3)。2.2.4層流混合、分流特征及優(yōu)化基于芯片的細胞研究分析是一種高通量的技術手段。作者所在課題組建立了一套集成化微流控芯片系統(tǒng),用于細胞凋亡研究。如圖4所示,該芯片利用微尺度下芯片通道內(nèi)的層流混合、分流特征,