發(fā)酵工程原理與技術(shù)課件

發(fā)酵工程原理與技術(shù)發(fā)酵工程原理與技術(shù)1第一章總論一、發(fā)酵工程的概念發(fā)酵的定義：利用生物細(xì)胞（含動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞），在合適的條件下，經(jīng)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樗璁a(chǎn)物或菌體的過(guò)程。發(fā)酵工程：是發(fā)酵原理與工程學(xué)的結(jié)合，是研究由生物細(xì)胞參與的工藝過(guò)程的原理和科學(xué)，是研究利用生物材料生產(chǎn)有用物質(zhì)，服務(wù)于人類的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。第一章總論一、發(fā)酵工程的概念2發(fā)酵工程

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利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等醫(yī)藥、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源等行業(yè)基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品化學(xué)工程生物化工生物加工行業(yè)傳統(tǒng)生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程菌發(fā)酵發(fā)酵工程──利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)醫(yī)藥、輕工、食3一、發(fā)酵工程的概念一般的，發(fā)酵工程又可稱為微生物工程，但嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，發(fā)酵（微生物培養(yǎng)）只是發(fā)酵工程的一部分，而不是全部，但是其核心內(nèi)容。通常，發(fā)酵工程分為兩大部分：發(fā)酵部分：主要是通過(guò)一系列的環(huán)節(jié)，提供條件，使菌體生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生發(fā)酵所要的目的產(chǎn)物（代謝產(chǎn)物）。提純部分：這部分是通過(guò)一些物理的、化學(xué)的手段、方法，將代謝產(chǎn)物從發(fā)酵醪中提純出來(lái)，獲得最終產(chǎn)品。一、發(fā)酵工程的概念4一、發(fā)酵工程的概念現(xiàn)代發(fā)酵工程是以天然生物體和人工修飾的生物體為加工對(duì)象，集現(xiàn)代化高新技術(shù)為一體，生產(chǎn)產(chǎn)品或服務(wù)于人類社會(huì)的一種工程技術(shù)?，F(xiàn)代發(fā)酵工程加工的對(duì)象生物，除天然生物菌種和變異微生物菌株外，還有基因工程菌、細(xì)胞融合菌以及動(dòng)植物細(xì)胞株。發(fā)酵工程的無(wú)菌概念已由原來(lái)的將雜菌排除再發(fā)酵系統(tǒng)外的單向概念轉(zhuǎn)變?yōu)橥瑫r(shí)要求發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的生物體不能逸出系統(tǒng)外的雙向概念。發(fā)酵的培養(yǎng)技術(shù)已不是簡(jiǎn)單的通氣攪拌培養(yǎng)技術(shù)，而是要根據(jù)生物的類型、目的產(chǎn)物的特征不同而采用更復(fù)雜的培養(yǎng)技術(shù)，并引入了生化工程放大概念。一、發(fā)酵工程的概念5二、發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)和分類獲得發(fā)酵產(chǎn)品的條件：適宜的微生物、保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件、進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備、精制成產(chǎn)品的方法的設(shè)備。發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)：1）發(fā)酵過(guò)程一般都在常溫常壓下進(jìn)行的生化反應(yīng)，反應(yīng)條件比較溫和。2）可采用廉價(jià)原材料，甚至可以利用廢物為發(fā)酵原材料生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品。3）發(fā)酵過(guò)程是通過(guò)生物體的自適應(yīng)調(diào)節(jié)來(lái)完成的，反應(yīng)的專一性強(qiáng)，因而，可以得到單一的代謝產(chǎn)物。4）發(fā)酵工業(yè)相對(duì)投資較少，見(jiàn)效較快，具有經(jīng)濟(jì)和效能的統(tǒng)一性。二、發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)和分類6二、發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)和分類發(fā)酵過(guò)程分類：根據(jù)發(fā)酵對(duì)氧的需要：厭氧和有氧發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵原料:糖質(zhì)原料和烴類原料發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵狀態(tài)：液體和固體發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵工藝類型：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵根據(jù)產(chǎn)物類型：食品發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵、維生素發(fā)酵、抗生素發(fā)酵等二、發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)和分類7三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程主要包括：原料預(yù)處理培養(yǎng)基配制無(wú)菌空氣的制備微生物菌種制備和擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)品的分離和純化三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程8發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)9三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵原料的預(yù)處理原料不同處理方法也有所差異。1.淀粉——利用前需變成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高壓、耐酸）、酶水解法2.糖蜜——加熱殺菌和用水沖稀，也可加酸處理后再補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽。3.碳?xì)浠衔铮菏兔撓灐欢s分的石油經(jīng)冷卻脫蠟而獲得的凝固點(diǎn)在-10℃的油，加入適量無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行接種發(fā)酵。三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程10三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌（1）目的要明確；（2）培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)；（3）pH要適宜。滅菌:主要采用高壓水蒸汽直接對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌，多采用121℃保溫20-30min，然后冷卻，這樣稱之為實(shí)罐滅菌；也可采用連續(xù)滅菌。三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程11三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程無(wú)菌空氣制備一般采用無(wú)菌空氣作為氧氣來(lái)源，高空采風(fēng)，經(jīng)空氣壓縮機(jī)加壓后采用加熱滅菌或過(guò)濾除菌。微生物種子的制備一般都是由保存于冷凍管及砂土管或冰箱中的斜面菌種開(kāi)始，在正式使用前要先轉(zhuǎn)接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，再用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)的方法可以根據(jù)需要采用固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)兩級(jí)不同方式。三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程12菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)13三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵過(guò)程的操作方式三種模式：間歇發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵間歇發(fā)酵又稱分批發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，除氣體進(jìn)出外，與外界沒(méi)有其它的物料交換。分批發(fā)酵是一種操作簡(jiǎn)單并且廣泛使用的發(fā)酵方式。連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)液的體積維持恒定，使微生物細(xì)胞處于近似恒定狀態(tài)下生長(zhǎng)的微生物發(fā)酵方式。流加發(fā)酵是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的發(fā)酵形式。發(fā)酵產(chǎn)品及分離提純工藝固液分離技術(shù)、細(xì)胞破碎技術(shù)、濃縮分離技術(shù)、精制技術(shù)、結(jié)晶技術(shù)等三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程14四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史發(fā)酵現(xiàn)象→釀造食品工業(yè)→非食品工業(yè)→青霉素→抗菌素發(fā)酵工業(yè)→氨基酸,核酸發(fā)酵（代謝控制發(fā)酵）→基因工程菌→動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→藻類細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1、發(fā)酵現(xiàn)象的早期認(rèn)識(shí)1680年制成顯微鏡───微生物的存在1857年巴斯德證明了酒精是由活的酵母發(fā)酵引起的1897年畢希納發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形成酒精───酶四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史15四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史2、發(fā)酵工程的早期階段人們的對(duì)發(fā)酵技術(shù)的認(rèn)識(shí)起始于19世紀(jì)末，主要來(lái)自于厭氧發(fā)酵，如利用酵母菌、乳酸菌生產(chǎn)酒精、乳酸和各種發(fā)酵食品。20世紀(jì)初期，1916年英國(guó)采用梭狀芽孢桿菌生產(chǎn)丙酮丁醇，德國(guó)采用亞硫酸鹽法生產(chǎn)甘油（第一次世界大戰(zhàn)）──由食品工業(yè)向非食品工業(yè)發(fā)展。3、發(fā)酵工程的重大轉(zhuǎn)折點(diǎn)二十世紀(jì)四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)?？股毓I(yè)的發(fā)展，建立了一套完整的好氧發(fā)酵技術(shù)，推動(dòng)了整個(gè)發(fā)酵工業(yè)的深入發(fā)展，現(xiàn)代發(fā)酵工程奠定了基礎(chǔ)。四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史16四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史3、發(fā)酵工程的重大轉(zhuǎn)折點(diǎn)20世紀(jì)70年代，細(xì)胞融合技術(shù)、基因技術(shù)等生物技術(shù)發(fā)展，打破了生物種間障礙，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物體內(nèi)控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的基因拷貝數(shù)，可以大幅度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。將動(dòng)、植物或某些微生物特有產(chǎn)物的控制基因植入細(xì)胞中，快速經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)這些產(chǎn)物。將具有不同性能的多種質(zhì)粒植入，使新菌株在清除污染或以非糧食物質(zhì)為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)或環(huán)境保護(hù)。四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史17四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史4、發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展目前，全球發(fā)酵產(chǎn)品的年銷售額在400億美元左右，并以每年約7％～8％的速率增長(zhǎng)。我國(guó)發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)有5000多家，主要發(fā)酵產(chǎn)品的年產(chǎn)值高達(dá)1300億元。發(fā)酵工程技術(shù)給人類社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展帶來(lái)了巨大的潛力，涉及到解決人類所面臨的食品與營(yíng)養(yǎng)、健康與環(huán)境、資源與能源等重大問(wèn)題。四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史18五、生物工程與發(fā)酵工程的關(guān)系

發(fā)酵工程是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)，是生物技術(shù)四大支柱的核心。發(fā)酵工程是生物技術(shù)產(chǎn)品走向工業(yè)化的必由之路。生物工程基因工程細(xì)胞工程酶工程產(chǎn)品發(fā)酵工程產(chǎn)物產(chǎn)品五、生物工程與發(fā)酵工程的關(guān)系生物工程基因工程細(xì)胞工程酶工程產(chǎn)19第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術(shù)第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第二節(jié)工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第三節(jié)種子培養(yǎng)基及其制備第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術(shù)第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微20一、工業(yè)微生物的特點(diǎn)工業(yè)微生物是指在發(fā)酵工業(yè)上已經(jīng)應(yīng)用的或具有潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物，其范圍隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷擴(kuò)展。工業(yè)微生物的特點(diǎn)：個(gè)體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強(qiáng)、易變異改造。第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育一、工業(yè)微生物的特點(diǎn)第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌21二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求（一）發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求1、能在廉價(jià)原料制備的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)并生成所需的代謝產(chǎn)物，且產(chǎn)量高；2、培養(yǎng)條件易于控制；3、生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵周期短；4、滿足代謝控制的要求；5、抗噬菌體和雜菌能力強(qiáng)；二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求22二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求（一）發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求6、遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化；7、在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫要少；8、對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力；并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源使用；9、不是病原菌，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無(wú)關(guān)，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)（包括抗生素、激素和病毒）以保證安全。二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求23（二）工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種1、細(xì)菌（Bacteria）

細(xì)菌是單細(xì)胞原核生物，具有環(huán)狀DNA染色體，以典型的二分分裂方式繁殖。(1)球細(xì)菌根據(jù)形態(tài)可分為三類：(2)桿細(xì)菌(3)

螺旋細(xì)菌

工業(yè)上常用的有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等。（二）工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種1、細(xì)菌（Bacteria）24

放線菌是介于細(xì)菌與絲狀真菌之間而又接近于細(xì)菌的一類絲狀單細(xì)胞原核生物。

因菌落呈放射狀而得名2、放線菌（Actinomycetes）抗生素有60％以上是放線菌產(chǎn)生的工業(yè)生產(chǎn)常用的放線菌主要來(lái)自以下幾個(gè)屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬、諾卡菌屬放線菌是介于細(xì)菌與絲狀真菌之間而又接近于細(xì)菌的一類絲253、酵母菌（Yeast）

酵母菌是單細(xì)胞真核生物，常以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖。c、不形成孢子只通過(guò)芽殖的“假酵母”屬半知菌。a、形成子囊孢子的株系屬于子囊菌門(mén)根據(jù)產(chǎn)生孢子的能力，可將酵母分成三類：b、形成擔(dān)孢子的株系屬于擔(dān)子菌門(mén)(黑粉菌目)工業(yè)上常用的有：啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等3、酵母菌（Yeast）酵母菌是單細(xì)胞真核生物，c264、霉菌（mould）

霉菌非系統(tǒng)演化分類的單元。凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀，網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌統(tǒng)稱霉菌。工業(yè)上常用的霉菌有：藻狀菌綱：根霉，毛霉，犁頭霉子囊菌綱：紅曲霉半知菌類：曲霉，青霉。4、霉菌（mould）霉菌非系統(tǒng)演化分類的單元275、擔(dān)子菌（Basidiomycetes）擔(dān)子菌是會(huì)產(chǎn)生擔(dān)子和擔(dān)孢子的真菌。擔(dān)子菌主要用于多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開(kāi)發(fā)。6、藻類（Alga）許多國(guó)家已把它作為人類保健食品和飼料。還可通過(guò)藻類將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)槭停粐?guó)外還有從“藻類農(nóng)場(chǎng)”獲得氫能的報(bào)道。5、擔(dān)子菌（Basidiomycetes）擔(dān)子菌是會(huì)產(chǎn)生擔(dān)子286、藻類（Alga）螺旋藻柵列藻單孢藻6、藻類（Alga）螺旋藻柵列藻單孢藻29三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育（一）微生物菌種的分離1、施加選擇壓力分離法

施加選擇壓力分離法是利用不同種類的微生物的生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)（如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等）的要求不同，人為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長(zhǎng)，而不利于其它種類微生物的生存，以達(dá)到使目的菌種占優(yōu)勢(shì)，而得以快速分離純化的目的。三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育（一）微生物菌種的分離1、30使用高糖或高鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可獲得耐高滲透壓的微生物控制培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)成分（如使某種碳源、氮源成為唯一的碳源、氮源），可使能利用此種營(yíng)養(yǎng)的微生物富集，從而大量獲得控制不同的pH條件，可分離出嗜酸和嗜堿微生物在高溫下培養(yǎng)，將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開(kāi)控制培養(yǎng)時(shí)的氧氣，將好氧微生物和厭氧微生物分開(kāi)在分離培養(yǎng)基中加入不同的抗生素或試劑來(lái)增加選擇性使用高糖或高鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可獲得耐高滲透壓的微生物控制培31具體培養(yǎng)方法有兩種方式：1、分批式富集培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)）2、恒化式富集培養(yǎng)（連續(xù)培養(yǎng)）重復(fù)移植幾次后，接種已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基，可將優(yōu)勢(shì)微生物分離出來(lái)。移種時(shí)間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌占優(yōu)勢(shì)時(shí)移種。

用于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的菌種選育特別適合。改變限制性基質(zhì)濃度可以控制兩種菌的比生長(zhǎng)速率。

具體培養(yǎng)方法有兩種方式：1、分批式富集培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)）2、恒322、隨機(jī)分離方法（1）抗生素產(chǎn)生菌的分離

抑菌圈法:工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，很容易被鑒別出來(lái)。如春雷霉素和青霉素等。除使用高靈敏度的工具菌外，可以利用專一性很強(qiáng)的酶，酶抑制劑，激活劑，抗體等建立高靈敏度，專一的篩選技術(shù)。2、隨機(jī)分離方法（1）抗生素產(chǎn)生菌的分離33（2）抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離臨床上抗腫瘤藥物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)，由于微生物和人的核酸結(jié)構(gòu)與生物合成方式有許多共同之處，所以大部分抗腫瘤藥物也具有抗菌活性，據(jù)此發(fā)展出利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法。<1>生化誘導(dǎo)分析法（BIA）<2>SOS顯色法原理一：（2）抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離臨床上抗腫瘤藥物大部分是34

生物體中都存在兩個(gè)以上的DNA修復(fù)基因，如果一個(gè)DNA修復(fù)基因損傷或變異，通常仍能存活，但對(duì)能引起DNA損傷的化合物十分敏感，易發(fā)生死亡，所以可以利用DNA修復(fù)能力突變株篩選抗腫瘤藥物。

實(shí)踐中常使用大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的重組缺失DNA修復(fù)基因突變株和親株作為測(cè)試菌來(lái)篩選抗腫瘤藥物。原理二：生物體中都存在兩個(gè)以上的DNA修復(fù)基因，如果一個(gè)DN35（3）酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離酶抑制劑的生產(chǎn)主要是為了治療某些疾病，如為治療糖尿病需要α－糖苷酶抑制劑（阻止淀粉等分解為可被吸收的單糖），為治療肥胖需要脂肪酶抑制劑（阻止對(duì)攝入的脂肪物質(zhì)的消化吸收）等等。酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選，主要以所需抑制的酶為靶酶進(jìn)行篩選。如果某種化合物能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)有藥理作用，所以可以在體外進(jìn)行篩選。（3）酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離酶抑制劑的生產(chǎn)主要是為了治36例：α－糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌分離α－糖苷酶包括淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶將待篩菌的菌絲提取物加入含α-淀粉酶和1％淀粉的溶液中，在適合淀粉酶水解淀粉的條件下經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，然后通過(guò)于540nm處比色測(cè)定OD值，確定淀粉的酶活力，如果酶活力被明顯抑制則證明此菌可產(chǎn)生α-淀粉酶抑制劑。例：α－糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌分離α－糖苷酶包括淀粉酶、蔗糖酶37例：脲酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離（阻止土壤中尿素分解損失）將不同地點(diǎn)分離的水稻土和廄肥中的待篩微生物的單菌落菌株接種在含2％尿素和0.1％酚紅的瓊脂培養(yǎng)基上形成單菌落（每一皿可以多接些菌株，如10株），培養(yǎng)一段時(shí)間后在培養(yǎng)基表面倒一層一定濃度的脲酶溶液，由于脲酶分解尿素產(chǎn)生堿性物質(zhì)會(huì)使含酚紅的培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，如果某個(gè)菌落周圍的培養(yǎng)基不變紅，則證明此菌會(huì)產(chǎn)生脲酶抑制劑。例：脲酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離將不同地點(diǎn)分離的水稻土和廄38（4）抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離b、用小平板測(cè)定由病毒引起的細(xì)胞變性效應(yīng)（CPE：Cytopathiceffect），更多稱細(xì)胞病變效應(yīng)。c、檢測(cè)病毒復(fù)制中特有的DNA復(fù)制酶和核酸合成酶的酶抑制劑。a、利用作用于核酸的方法，如噬菌斑法。如：殼二孢氯素、衣霉素的分離（4）抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離b、用小平板測(cè)定由病毒引起的細(xì)胞39（5）生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離

通過(guò)觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)，來(lái)檢出生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌。

例如氨基酸產(chǎn)生菌的篩選：首先將待試菌接入加了抗真菌化合物（如亞胺環(huán)己酮）的分離培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后采用影印法，將菌落復(fù)印到能支持氨基酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3d后，用紫外線殺死長(zhǎng)好的菌落，再往此平板上面鋪一層含有相應(yīng)氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株懸液，培養(yǎng)16h后，被殺死的氨基酸產(chǎn)生菌的菌落周圍應(yīng)有一檢測(cè)菌的生長(zhǎng)圈。這樣在另一個(gè)復(fù)印的平板相應(yīng)的位置上便可以找出產(chǎn)生菌。（5）生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離通過(guò)觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺40（6）免疫激活劑產(chǎn)生菌的分離現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞表面的氨基肽酶B，氨基肽酶A，堿性磷酸脂酶會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞性免疫或抗體產(chǎn)生能力，所以可以利用細(xì)胞表面酶的抑制法來(lái)篩選免疫激活劑產(chǎn)生菌。（6）免疫激活劑產(chǎn)生菌的分離現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞表面的氨41（7）多糖產(chǎn)生菌的分離一般認(rèn)為制糖工業(yè)，食品加工廠等產(chǎn)生的污水中，可能含有較多的多糖產(chǎn)生菌，并且這類菌的菌落外觀一般比較粘稠，可以通過(guò)菌落外觀的觀察來(lái)識(shí)別。（7）多糖產(chǎn)生菌的分離一般認(rèn)為制糖工業(yè)，食品加工廠等產(chǎn)42（二）微生物菌種的選育1、自然選育

不經(jīng)過(guò)人工處理，利用微生物自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程稱為自然選育。自然選育的一般程序是將菌種制成菌懸液，用稀釋法在固體平板上分離單菌落，再分別測(cè)定單菌落的生產(chǎn)能力，從中選出高水平菌種。自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種，防止菌種退化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量的目的。（二）微生物菌種的選育1、自然選育不經(jīng)過(guò)人工處理，利用432、誘變選育誘變育種是利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。2、誘變選育誘變育種是利用各種被稱為誘變劑的物理因素44（1）誘變育種的原理

誘變育種的理論基礎(chǔ)是突變，主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。染色體畸變指的是染色體或DNA片段發(fā)生缺失，易位，逆位，重復(fù)等?；蛲蛔冎傅氖荄NA中的堿基發(fā)生變化即點(diǎn)突變。（1）誘變育種的原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是突變，主要45（2）誘變育種的基本方法誘變育種一般包括誘變和篩選兩個(gè)部分，是誘變和篩選過(guò)程的不斷重復(fù)，直到獲得高產(chǎn)菌株。A、誘變誘變的關(guān)鍵包括出發(fā)菌株的選擇，誘變劑種類和劑量的選擇以及合理的使用。（2）誘變育種的基本方法誘變育種一般包括誘變和篩選兩個(gè)46a、出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。其它生產(chǎn)性能如生長(zhǎng)繁殖快，營(yíng)養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多而早，對(duì)誘變劑敏感，變異幅度大等?？梢赃x擇已經(jīng)誘變處理的菌株，因?yàn)槠鋵?duì)誘變劑的敏感性會(huì)有所提高。b、誘變劑種類的選擇單一誘變劑處理復(fù)合誘變劑處理a、出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力47c、誘變劑劑量的選擇誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率又與突變率有一定的關(guān)系，因此可用致死率作為誘變劑劑量選擇的依據(jù)。一般突變率隨誘變劑劑量的增加而提高，但達(dá)到一定的程度以后，再提高劑量反使突變率下降。c、誘變劑劑量的選擇誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率48B、篩選誘變處理后，正向突變的菌株通常為少數(shù)，要用各種方法篩選出來(lái)a、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

某些菌株發(fā)生突變（自然突變或人工誘變）后，失去合成某種（或某些）對(duì)該菌株生長(zhǎng)必不可少的物質(zhì)（通常是生長(zhǎng)因子如氨基酸，維生素）的能力，必須從外界環(huán)境獲得該物質(zhì)才能生長(zhǎng)繁殖，這種突變型菌株稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。（a）營(yíng)養(yǎng)缺陷型定義B、篩選誘變處理后，正向突變的菌株通常為少數(shù)，要用各種49（b）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的意義在營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株中，生物合成途徑中的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。只要在培養(yǎng)基中限量加入所要求的末端產(chǎn)物，克服生長(zhǎng)障礙，就能使中間產(chǎn)物積累。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株具有明顯的遺傳標(biāo)記，在雜交育種中作為出發(fā)菌株，有利于雜交重組的分析。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株具有明顯的遺傳標(biāo)記，可以作為基因工程中的受體菌，檢出克隆基因的表達(dá)。（b）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的意義在營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株中，生物合成50（c）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選首先：淘汰野生型，濃縮缺陷型

經(jīng)誘變處理后，缺陷型還是相當(dāng)少的，必須設(shè)法淘汰野生型細(xì)胞，提高營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所占比例，以達(dá)到濃縮缺陷型的目的。（c）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選首先：淘汰野生型，濃縮缺陷型51有青霉素法和制霉菌素法等數(shù)種。青霉素法適用于細(xì)菌，青霉素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，殺死正在繁殖的野生型細(xì)菌，但無(wú)法殺死正處于休止?fàn)顟B(tài)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌。制霉菌素法則適合于真菌，制霉菌素可與真菌細(xì)胞膜上的甾醇作用，從而引起膜的損傷，也是只能殺死生長(zhǎng)繁殖著的酵母菌或霉菌。在基本培養(yǎng)基中加入抗生素，野生型生長(zhǎng)被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型不能在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被保留下來(lái)得以濃縮。

(1)抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等數(shù)種。青霉素法適用于細(xì)菌，青霉52適用于進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。通過(guò)過(guò)濾就可除去大部分野生型，保留下?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺陷型。(2)菌絲過(guò)濾法適用于進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)53然后：檢出缺陷型

先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆一一標(biāo)在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。(1)夾層培養(yǎng)法

然后：檢出缺陷型先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培54把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長(zhǎng)成較大的菌落，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型則緩慢生長(zhǎng)成小菌落。若需獲得某一特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。(2)限量補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)法

(3)影印平板法

可以將誘變后的菌液稀釋后接種在完全培養(yǎng)基上，使之形成單株菌落，然后將菌落分別影印到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，那些在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌落就是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的菌落，到完全培養(yǎng)基的相應(yīng)位置就可以得到營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（＜0.01%）蛋白55完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)成單孢菌落無(wú)菌絲絨布橡皮箍圓木柱輕壓在絨布上接上所有菌落的絨布轉(zhuǎn)印在新鮮的培養(yǎng)基上基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基所有菌都長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型不長(zhǎng)(3)影印平板法

完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)成單孢菌落無(wú)菌絲絨布橡皮箍圓木柱輕壓在絨布上接56b、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙甑暮Y選末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)在生物合成途徑中普遍存在?？狗答?zhàn)瓒艉涂狗答佉种苾煞N突變均是由于代謝失調(diào)，它們有共同的表型，即在細(xì)胞中已經(jīng)有了大量的末端產(chǎn)物時(shí)仍不斷合成這一產(chǎn)物。（a）因?yàn)檎{(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因。因此不再起反饋?zhàn)瓒糇饔?。（b）由于編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力，但仍具有催化活性，從而解除反饋抑制。代謝失調(diào)的原因：b、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙甑暮Y選末端產(chǎn)物的反57篩選方法1：通常抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙晔峭ㄟ^(guò)抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選出來(lái)的。結(jié)構(gòu)類似物與末端產(chǎn)物具有相似的結(jié)構(gòu)，能與阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合，阻止產(chǎn)物的合成，引起反饋調(diào)節(jié)作用，但它們不能代替末端產(chǎn)物參與生物合成，它們的濃度不會(huì)降低，因此，它們與阻遏蛋白或變構(gòu)酶的結(jié)合是不可逆的。未突變的細(xì)胞因代謝受阻，不能合成某種產(chǎn)物而死亡?？狗答佌{(diào)節(jié)的突變株則即使在結(jié)構(gòu)類似物存在的條件下仍可以合成末端產(chǎn)物形成菌落。篩選方法1：通常抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙晔峭ㄟ^(guò)58篩選方法2：可以從營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株獲得抗反饋突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株是因?yàn)閷?duì)反饋調(diào)節(jié)作用敏感的酶鈍化或缺失等原因所致，發(fā)生回復(fù)突變后，雖然酶的催化活性恢復(fù)了，但酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，對(duì)反饋調(diào)節(jié)作用不敏感，因此可過(guò)量積累末端代謝產(chǎn)物。篩選方法2：可以從營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株獲得抗反饋突59c、組成型突變株的篩選微生物的產(chǎn)酶過(guò)程通常都受到底物誘導(dǎo)、終產(chǎn)物或分解代謝物的阻遏等機(jī)制的調(diào)節(jié)，為了解除對(duì)誘導(dǎo)物的依賴，擺脫阻遏調(diào)節(jié)，須篩選組成型突變株。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對(duì)誘導(dǎo)物的依賴,可獲組成型突變株。篩選方法：設(shè)計(jì)條件使組成型優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，或通過(guò)菌落分辨。①加誘導(dǎo)酶合成抑制物②交替培養(yǎng)法③顯色反應(yīng)法c、組成型突變株的篩選微生物的產(chǎn)酶過(guò)程通常都受到底物60例1：加誘導(dǎo)酶合成抑制物以β-半乳糖苷酶生產(chǎn)為例，將誘變處理后的菌種培養(yǎng)在含有抑制物鄰硝基-β-D-巖藻糖苷和乳糖的培養(yǎng)液中。在這種培養(yǎng)液中，β-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此誘導(dǎo)型菌株不能利用乳糖，則不能生長(zhǎng)，而組成型菌株能夠合成β-半乳糖苷酶，利用乳糖生長(zhǎng)，使組成型被富集。例1：加誘導(dǎo)酶合成抑制物61例2：交替培養(yǎng)法將誘導(dǎo)型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含誘導(dǎo)劑如乳糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，由于組成型的菌株不需誘導(dǎo)物就能合成β-半乳糖苷酶，利用乳糖，因此它會(huì)先于誘導(dǎo)型開(kāi)始生長(zhǎng)，在一段時(shí)間內(nèi)，它們的菌數(shù)會(huì)增加很快。當(dāng)誘導(dǎo)型在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下合成β-半乳糖苷酶，開(kāi)始利用乳糖生長(zhǎng)時(shí)，就將細(xì)菌全部轉(zhuǎn)入葡萄糖培養(yǎng)基中，在葡萄糖培養(yǎng)基中兩類菌同樣生長(zhǎng)繁殖，但是組成型菌株仍能合成β-半乳糖苷酶，而誘導(dǎo)型菌株的β-半乳糖苷酶合成停止，并且酶活力逐漸喪失。這時(shí)再將全部細(xì)菌轉(zhuǎn)入乳糖培養(yǎng)基，組成型菌株又獲得一次優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。如此反復(fù)多次后，組成型菌株數(shù)量大大超過(guò)誘導(dǎo)型菌株，然后用平板培養(yǎng)基分離出組成型菌株的單菌落。例2：交替培養(yǎng)法62例3：顯色反應(yīng)法利用顯色反應(yīng)在平板上識(shí)別組成型菌株。在不含誘導(dǎo)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于組成型菌株能產(chǎn)生酶，培養(yǎng)后加入適當(dāng)?shù)乃a(chǎn)生的酶的底物反應(yīng)。常采用經(jīng)酶解后有顏色變化的底物，以便快速檢出組成型菌落。如：用鄰硝基苯半乳糖苷來(lái)篩選β-半乳糖苷酶組成突變型。(鄰硝基苯半乳糖苷被分解后生成黃色的硝基苯酚)如：用剛果紅來(lái)篩選纖維素酶組成突變型。（剛果紅可使纖維素酶水解纖維素露出的還原基被染上色）例3：顯色反應(yīng)法63包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染③條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量④物敏突變：提高產(chǎn)量d、抗性突變株的篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體d、抗性突變株的篩選64抗性突變菌株的篩選

抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過(guò)篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量?？股乜剐酝蛔冎瓿芴岣呖股氐漠a(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。條件抗性突變株因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為"野生型"菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死營(yíng)養(yǎng)缺陷抗性突變菌株的篩選抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，65抗性突變菌株的篩選方法

一次性篩選法

一次性篩選法就是指在對(duì)出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株抗性突變菌株的篩選方法一次性篩選法一次性篩選法就是指在66

階梯性篩選法

梯度平板法

紙片擴(kuò)散法

用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號(hào)）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。階梯性篩選法梯度平板法紙片擴(kuò)散法用打孔器將較厚的濾紙673、雜交育種（1）雜交育種的優(yōu)點(diǎn)a、通過(guò)具有不同遺傳性狀菌株的雜交，使遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大變異范圍，使兩株的優(yōu)良性狀集中在重組體內(nèi)，獲得新品種。b、通過(guò)雜交后獲得具有新遺傳特性的重組體，不僅可克服因長(zhǎng)期誘變?cè)斐傻纳盍ο陆担x緩慢等缺陷，也可以提高對(duì)誘變劑的敏感性，降低對(duì)誘變劑的疲勞效應(yīng)。c、通過(guò)雜交可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，豐富并促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。3、雜交育種（1）雜交育種的優(yōu)點(diǎn)a、通過(guò)具有不同遺傳性狀菌株68（2）雜交育種的方法微生物常規(guī)雜交形式（2）雜交育種的方法微生物常規(guī)雜交形式694、原生質(zhì)體融合（1）原生質(zhì)體融合法的定義原生質(zhì)體融合法是首先用酶分別酶解兩個(gè)出發(fā)菌株的細(xì)胞壁，在高滲的環(huán)境下釋放出原生質(zhì)，將它們混合，在助融劑或電場(chǎng)的作用下，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，實(shí)現(xiàn)遺傳重組。4、原生質(zhì)體融合（1）原生質(zhì)體融合法的定義原生質(zhì)體融70（2）原生質(zhì)體融合法的優(yōu)越性a、受接合型和致育型的限制小，兩親株沒(méi)有供體和受體之分，有利于不同種屬微生物的雜交。b、重組頻率高于其他雜交方法。c、遺傳物質(zhì)的傳遞更加充分、完善，既有核配又有質(zhì)配。d、可以用溫度、藥物、紫外線等處理純化親株的一方或雙方，然后使其融合，篩選再生重組子菌落，提高篩選效率。e、用微生物的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，可明顯提高誘變頻率。（2）原生質(zhì)體融合法的優(yōu)越性a、受接合型和致育型的限制小，兩71（3）原生質(zhì)體融合法的步驟a、原生質(zhì)體制備b、原生質(zhì)體融合c、原生質(zhì)體再生d、融合子的檢出（3）原生質(zhì)體融合法的步驟a、原生質(zhì)體制備b、原生質(zhì)體融合c725、基因工程育種基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來(lái)，在離體的條件下進(jìn)行“切割”，獲得代表某一性狀的目的基因，把該基因與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，讓外來(lái)的目的基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，從而獲得目的產(chǎn)物。由于該受體細(xì)胞即包含了原有的一整套遺傳信息，同時(shí)也含有外來(lái)基因的遺傳信息，是一個(gè)自然演化中根本不存在的全新物種。5、基因工程育種基因工程是用人為的方法將所需的某一供73攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀?4（1）基因的分離去垢劑（如SDS）溶解細(xì)胞；用酚和蛋白酶除去蛋白質(zhì)；核糖核酸酶除去RNA；乙醇沉淀。a、總DNA提?。篵、分離特定的目的基因：物理分離法；互補(bǔ)DNA分離法；“鳥(niǎo)槍法”（1）基因的分離去垢劑（如SDS）溶解細(xì)胞；用酚和蛋白酶除去75（2）DNA分子的切割與連接（2）DNA分子的切割與連接76（a）粘性末端連接：用同一種限制性內(nèi)切酶或者用能夠產(chǎn)生相同粘性末端的兩種限制性內(nèi)切酶分別消化外源DNA分子和載體，所形成的DNA末端彼此互補(bǔ)，用DNA連接酶共價(jià)連接起來(lái)，形成重組體DNA分子。

（a）粘性末端連接：77（b）平頭末端連接：將平末端的DNA分子在T4DNA連接酶催化下，使DNA分子的3′OH和5′P進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。（c）人工接頭法：指利用人工接頭加在平端DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶相同黏性末端的載體相連。

（d）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，在線型載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾；而在目的DNA分子的兩端加上dC尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶Ⅰ或Klenow填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過(guò)DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。

（b）平頭末端連接：將平末端的DNA分子在T4DNA連接酶催78（3）載體a、常用的載體質(zhì)粒λ噬菌體黏粒單鏈?zhǔn)删wM13（3）載體a、常用的載體質(zhì)粒λ噬菌體黏粒單鏈?zhǔn)删wM1379b、載體應(yīng)具備的特點(diǎn)（a）載體本身是一個(gè)單獨(dú)的復(fù)制子，在共價(jià)連接了外源DNA后仍能自我復(fù)制。（b）對(duì)某些限制酶只有一個(gè)切口，并在酶作用后不影響其自主繁殖能力。（c）從細(xì)菌核酸中分離和純化很容易。（d）在宿主中能以多拷貝的形式存在，有利于插入的外源基因的表達(dá)，能在宿主中穩(wěn)定地遺傳。b、載體應(yīng)具備的特點(diǎn)（a）載體本身是一個(gè)單獨(dú)的復(fù)制子，在共價(jià)80（4）引入宿主（5）重組體的選擇和鑒定:分兩步a、先根據(jù)載體的遺傳標(biāo)記等選擇出含有重組分子的細(xì)胞。b、進(jìn)一步根據(jù)外源DNA的遺傳特性進(jìn)行鑒定。（6）外源基因的表達(dá)影響外源基因表達(dá)的因素（4）引入宿主（5）重組體的選擇和鑒定:分兩步a、先根據(jù)載體81四、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏（一）微生物菌種的退化及原因1、菌種退化

菌種退化通常指在較長(zhǎng)時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。四、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏（一）微生物菌種的退822、引起菌種退化的原因（1）基因突變（2）變異菌株性狀分離（廣義的退化）（3）連續(xù)傳代（4）其它因素2、引起菌種退化的原因（1）基因突變（2）變異菌株性狀分離（83（二）防止菌種的退化和退化菌種的復(fù)壯1、防止菌種退化的方法（1）控制傳代次數(shù)（2）選擇合適的培養(yǎng)條件（3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（4）選擇合適的保藏方法（二）防止菌種的退化和退化菌種的復(fù)壯1、防止菌種退化的方法（842、退化菌種的復(fù)壯復(fù)壯：使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性稱為復(fù)壯。常用方法：對(duì)已退化菌株用一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞分離純化，淘汰已退化菌落而使原菌株得以復(fù)壯。2、退化菌種的復(fù)壯復(fù)壯：使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性稱85（三）菌種的保藏1、菌種保藏的意義2、菌種保藏的原理3、菌種保藏的方法（1）斜面低溫保藏法（2）石蠟油封保藏法（3）砂土管保藏法（4）冷凍干燥法（5）超低溫保藏法（三）菌種的保藏1、菌種保藏的意義2、菌種保藏的原理3、菌種86第二節(jié)工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管等中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)搖瓶或靜置培養(yǎng)及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。

第二節(jié)工業(yè)微生物種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指87發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的種子的必須滿足以下條件：

1、菌體培養(yǎng)物總量適宜，以保證在發(fā)酵罐中有適當(dāng)?shù)慕臃N量。

2、菌種的生命力旺盛，移接到發(fā)酵罐中后能迅速生長(zhǎng)，延滯期短。

3、菌種能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，生理狀態(tài)穩(wěn)定。4、無(wú)雜菌和噬菌體污染。

發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的種子的必須滿足以下條件：1、菌體培養(yǎng)物88一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量代謝旺盛的種子。二、種子制備的過(guò)程1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要為每只892、實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段目的是為種子罐提供種子，包括瓊脂斜面、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)或搖瓶液體培養(yǎng)。（1）固體斜面菌種培養(yǎng)（2）固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)（3）搖瓶液體培養(yǎng)2、實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段目的是為種子罐提903、生產(chǎn)車間種子制備（1）種子罐培養(yǎng)基（2）種子罐接種微孔接種法：利用注射器在罐的接種口橡皮膜上注入罐內(nèi)進(jìn)行接種。（3）種子罐級(jí)數(shù)種子罐級(jí)數(shù)是指制備種子需要逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。二級(jí)發(fā)酵；三級(jí)發(fā)酵3、生產(chǎn)車間種子制備（1）種子罐培養(yǎng)基（2）種子罐接種91細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵。孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（27?C,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級(jí)種子罐（27?C,10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐

放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵。酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子。細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。92確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響；級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面。種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)；確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接93（4）菌種的種齡菌種的種齡是指種子罐中的培養(yǎng)物移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。（5）種子罐和發(fā)酵罐的接種量雙種法：用兩只種子罐接種一只發(fā)酵罐的接種方法。倒種法：從一只發(fā)酵罐中倒出適宜的，適量的發(fā)酵液給另一發(fā)酵罐做種子的方法。（4）菌種的種齡菌種的種齡是指種子罐中的培養(yǎng)物移入下一94（5）接種量接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度。通常接種量，細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%、有時(shí)20~25%。

移入種子的體積接種量＝—————————接種后培養(yǎng)液的體積（5）接種量移入種子的體積95三、發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法⑴靜置培養(yǎng)法（厭氣性發(fā)酵）⑵通氣性培養(yǎng)（好氣性發(fā)酵）

作為種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法：①表面培養(yǎng)法②固體培養(yǎng)法③液體培養(yǎng)法（三角瓶搖床震蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)）④載體培養(yǎng)法三、發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法96淺盤(pán)固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)法（曲法培養(yǎng)）固體培養(yǎng)法（曲法培養(yǎng)）97優(yōu)點(diǎn)：（1）酶活力高。（2）生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)菌程度要求不很嚴(yán)格。（3）對(duì)于固體發(fā)酵，由于產(chǎn)物濃度大，易于分離，可以有效的降低產(chǎn)品分離成本。缺點(diǎn)：（1）生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度較大，占地面積大，不宜自動(dòng)化生產(chǎn)。（2）周期長(zhǎng)。（3）培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境條件控制較難。（4）生產(chǎn)過(guò)程中，由于無(wú)菌程度較低，其菌種不純。優(yōu)點(diǎn)：98液體深層培養(yǎng)法液體深層培養(yǎng)法99優(yōu)點(diǎn)：（1）生產(chǎn)效率高，便于自動(dòng)化管理。（2）生產(chǎn)過(guò)程中溫度、溶氧、pH值等參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)全面控制。（3）通常生產(chǎn)液體種子，整個(gè)生產(chǎn)周期較短。缺點(diǎn)：（1）無(wú)菌程度要求高，相對(duì)生產(chǎn)設(shè)備投資較大。（2）對(duì)于某些種類的發(fā)酵，液體培養(yǎng)因投資大、生產(chǎn)密度大而難以實(shí)現(xiàn)。優(yōu)點(diǎn)：100幾種深層培養(yǎng)法

①放大法②兩步法③控制培養(yǎng)法④分批培養(yǎng)法(間歇發(fā)酵法)⑤連續(xù)培養(yǎng)法⑥補(bǔ)料分批培養(yǎng)法(流加法)

幾種深層培養(yǎng)法①放大法101種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力。菌種穩(wěn)定性的檢查無(wú)雜菌檢查種子液生化分析項(xiàng)目主要有：營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的消耗速度、pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等。四、影響種子培養(yǎng)的因素和種子質(zhì)量的控制1、種子質(zhì)量的判斷2、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力。種102影響種子質(zhì)量的因素接種量種齡染菌控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件3、影響種子質(zhì)量的因素影響種子質(zhì)量接種量種齡染菌控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件3、影響種子質(zhì)量103

主要是碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素和水等。糖份少而氮源多些(菌體增殖為主要目的)。與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。*培養(yǎng)基：*培養(yǎng)基：104

*種齡和接種量：*種齡和接種量：105

溫度過(guò)低，菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。溫度過(guò)高，會(huì)使菌絲過(guò)早自溶。濕度低，孢子生長(zhǎng)快。濕度大，孢子生長(zhǎng)慢。*培養(yǎng)溫度和濕度：*培養(yǎng)溫度和濕度：106

選擇最適種子培養(yǎng)pH的原則是獲得最大比生長(zhǎng)速率和適當(dāng)?shù)木?。培養(yǎng)最后一級(jí)種子的培養(yǎng)基的pH應(yīng)接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應(yīng)新的環(huán)境。*pH：*pH：107

溶解氧的作用：參與菌體呼吸作用攪拌：促進(jìn)氧的溶解與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的分散。通氣量的多少以溶解氧的多少來(lái)衡定（溶解氧濃度應(yīng)不低于臨界溶氧濃度）。通氣過(guò)程中，影響溶解氧的因素：菌種（絲狀影響最大）；培養(yǎng)基性質(zhì)；培養(yǎng)階段；發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)。*通風(fēng)和攪拌：*通風(fēng)和攪拌：108

危害：影響微生物對(duì)氧的吸收；妨礙CO2的排除；減少設(shè)備利用率（有效容積減少）；造成跑料，導(dǎo)致染菌；消泡方法：（1）消泡劑：天然動(dòng)植物油、石油化工礦物油；改性油，表面活性劑（有機(jī)硅聚合物）；（2）機(jī)械消泡（3）改變培養(yǎng)基成分*泡沫：*泡沫：109

染菌原因：設(shè)備、管道、閥門(mén)漏損、發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)“死角”、滅菌不徹底、空氣凈化不好、無(wú)菌操作不嚴(yán)、菌種不純*染菌的控制：*染菌的控制：110

種子罐級(jí)數(shù)越少，越有利于簡(jiǎn)化工藝，便于控制，減少染菌。種子罐級(jí)數(shù)取決于：①種子的性質(zhì)（生長(zhǎng)繁殖性能）②孢子瓶中孢子的密度（密度大則級(jí)數(shù)少）③孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度④發(fā)酵罐中種子的最低接種量⑤種子罐與發(fā)酵罐的容積比*種子罐級(jí)數(shù)的決定：*種子罐級(jí)數(shù)的決定：1114、種子異常的分析（1）菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過(guò)快無(wú)菌空氣溫度低和滅菌質(zhì)量差是種子生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的主要原因。（2）菌絲結(jié)團(tuán)原因：攪拌效果差，接種量小。危害：影響菌的呼吸和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。（3）菌絲粘壁原因：攪拌效果不好，泡沫過(guò)多，種子裝料系數(shù)過(guò)小。危害：培養(yǎng)液菌絲濃度減少，可能形成菌絲團(tuán)。4、種子異常的分析（1）菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過(guò)快無(wú)菌空112第三節(jié)種子培養(yǎng)基及其制備一、菌體組成和細(xì)胞外代謝產(chǎn)物1、菌體組成2、細(xì)胞外代謝產(chǎn)物第三節(jié)種子培養(yǎng)基及其制備一、菌體組成和細(xì)胞外代謝產(chǎn)物1、113微生物的代謝產(chǎn)物可分為：初級(jí)代謝產(chǎn)物定義：微生物通過(guò)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的、自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等。特征：不同的微生物初級(jí)代謝產(chǎn)物基本相同；初級(jí)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程是連續(xù)不斷的；與菌體的生長(zhǎng)呈平行關(guān)系。微生物的代謝產(chǎn)物可分為：114

次級(jí)代謝產(chǎn)物定義：微生物生長(zhǎng)到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該微生物無(wú)明顯生理功能，或并非是微生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：抗生素、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物不同；次級(jí)代謝產(chǎn)物的通常在菌體的生長(zhǎng)后期合成；發(fā)酵分兩個(gè)階段進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)增殖期和生產(chǎn)期。在多數(shù)情況下，增加前體是有效的。次級(jí)代謝產(chǎn)物115兩種代謝產(chǎn)物的不同：1、次級(jí)代謝通常在生長(zhǎng)后期合成。不是微生物生長(zhǎng)所必需的，不參與微生物的生長(zhǎng)和繁殖。2、次級(jí)代謝對(duì)環(huán)境條件的變化很敏感，其產(chǎn)物的合成往往會(huì)因環(huán)境條件的變化而停止。3、不同微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物有很大區(qū)別。基于菌種的特異性。4、催化次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的某些酶專一性不強(qiáng)。兩種代謝產(chǎn)物的不同：1、次級(jí)代謝通常在生長(zhǎng)后期合成。不是微生1163、微生物的營(yíng)養(yǎng)類型碳源利用自養(yǎng)型異養(yǎng)型能量來(lái)源光能營(yíng)養(yǎng)型化能營(yíng)養(yǎng)型電子供體有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型光能有機(jī)異養(yǎng)型光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型化能有機(jī)異養(yǎng)型絕大部分微生物3、微生物的營(yíng)養(yǎng)類型碳源利用自養(yǎng)型異養(yǎng)型能量來(lái)源光能營(yíng)養(yǎng)型化117二、種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配置原則1、種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及來(lái)源（1）碳源物質(zhì)a、碳源物質(zhì)作用b、種子培養(yǎng)基的碳源物質(zhì)：葡萄糖、糊精等核酸碳可占細(xì)胞干重的50％左右蛋白質(zhì)脂質(zhì)（a）提供合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)所需碳素（b）提供能源二、種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配置原則1、種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及118（2）氮源物質(zhì)a、氮源物質(zhì)作用核酸蛋白質(zhì)（a）提供合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)所需氮素（b）碳源不足時(shí)可為某些厭氧微生物提供能源b、種子培養(yǎng)基的氮源物質(zhì)尿素、玉米漿、蛋白胨等通常有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源聯(lián)合使用營(yíng)養(yǎng)豐富吸收迅速（2）氮源物質(zhì)a、氮源物質(zhì)作用核酸蛋白質(zhì)（a）提供合成細(xì)胞結(jié)119（3）無(wú)機(jī)鹽類a、無(wú)機(jī)鹽類的作用（a）提供合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)所需元素（b）作為酶的組成部分或維持酶的活性（c）調(diào)節(jié)滲透壓、pH、氧化還原電位等b、種子培養(yǎng)基所需無(wú)機(jī)鹽（a）大量元素：P、S、K、Mg、Ca等（b）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等（3）無(wú)機(jī)鹽類a、無(wú)機(jī)鹽類的作用（a）提供合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)所120（4）生長(zhǎng)因子維生素、生物素、硫胺素、肌醇等（5）水水的作用（a）細(xì)胞重量的絕大部分（b）良好的溶劑（c）各種生化反應(yīng)必須在水溶液中進(jìn)行（4）生長(zhǎng)因子維生素、生物素、硫胺素、肌醇等（5）水水的作用1212、培養(yǎng)基的類型和用途天然培養(yǎng)基是利用動(dòng)、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，其化學(xué)成分還不清楚，比較復(fù)雜。缺點(diǎn)：成分不穩(wěn)定。取材方便、營(yíng)養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便、成本低廉優(yōu)點(diǎn)：（1）根據(jù)原料劃分a、天然培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的類型和用途天然培養(yǎng)基是利用動(dòng)、植物122b、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是利用化學(xué)成分明確的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，配制繁瑣。優(yōu)點(diǎn)：成分精確，重演性高半合成培養(yǎng)基是既含有天然成分有含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。c、半合成培養(yǎng)基b、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是利用化學(xué)成分明確的物123（2）根據(jù)培養(yǎng)基外觀物理狀態(tài)劃分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基（3）根據(jù)培養(yǎng)基功能劃分孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基（2）根據(jù)培養(yǎng)基外觀物理狀態(tài)劃分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固1243、培養(yǎng)基的配制原則（1）選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適氮源不足：菌體生長(zhǎng)過(guò)于緩慢。碳源不足：菌體衰老和自溶。高濃度糖類物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等有抑菌和殺菌作用。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間的濃度配比直接影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，其中碳氮比（C/N）尤其重要。3、培養(yǎng)基的配制原則（1）選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃125（3）選擇合適的pH（4）氧化還原電位厭氧菌的培養(yǎng)基中往往要加入還原劑來(lái)降低氧化還原電位。

微生物的正常生長(zhǎng)均需要合適的pH，一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細(xì)菌適于中性或微堿性環(huán)境。（3）選擇合適的pH（4）氧化還原電位厭氧菌的培養(yǎng)基1264、培養(yǎng)基成分配比的選擇（1）種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基一般要求營(yíng)養(yǎng)成分適當(dāng)豐富和完全些，尤其是氮源的含量應(yīng)該較高。（即C/N比值低）

營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株應(yīng)添加生長(zhǎng)因子。

培養(yǎng)基的成分必須是一些容易被菌體直接吸收利用的物質(zhì)，保證其旺盛生長(zhǎng)。

種子罐種子還要考慮和發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近。4、培養(yǎng)基成分配比的選擇（1）種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基一127（2）孢子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不能太豐富，碳、氮源不宜過(guò)多，特別是有機(jī)氮源要低，否則不易形成孢子。無(wú)機(jī)鹽的濃度要適當(dāng)，否則會(huì)影響孢子的顏色和孢子的數(shù)量。（2）孢子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不能太豐富，碳、氮源不宜過(guò)多，特128發(fā)酵工程的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐發(fā)酵罐培養(yǎng)基制備滅菌滅菌產(chǎn)物分離純化成品原料預(yù)處理發(fā)酵工程的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐129第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分第二節(jié)淀粉水解糖的制備第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌第三章發(fā)酵工業(yè)原料及其處理第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分第三章發(fā)酵工業(yè)原料及130發(fā)酵培養(yǎng)基是要求最嚴(yán)格的培養(yǎng)基，它具有雙重任務(wù)，一是供菌體生長(zhǎng)繁殖，二是使菌種能夠大量產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品。因此,發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分即要豐富和完全，有要求嚴(yán)格控制，尤其是那些對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的形成有嚴(yán)重影響的成分。發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分除碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等物質(zhì)外，還要有前體、促進(jìn)劑和抑制劑等物質(zhì)。第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分一、發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的定量及原料發(fā)酵培養(yǎng)基是要求最嚴(yán)格的培養(yǎng)基，它具有雙重任務(wù)，一是供1311、碳源物質(zhì)一、發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的定量及原料第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分（1）碳源物質(zhì)作用

a、提供合成細(xì)胞物質(zhì)所需碳素b、提供能源（生長(zhǎng)及合成產(chǎn)物）c、提供目的產(chǎn)物中的碳（2）碳源物質(zhì)淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、有機(jī)酸、低碳醇、脂類、烴類1、碳源物質(zhì)一、發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的定量及原料第一節(jié)132（3）工業(yè)上常用作碳源的淀粉質(zhì)原料a、淀粉的性質(zhì)不同產(chǎn)地甘薯的淀粉顆粒（3）工業(yè)上常用作碳源的淀粉質(zhì)原料a、淀粉的性質(zhì)不同產(chǎn)地甘薯133b、淀粉質(zhì)原料（a）工業(yè)淀粉谷類淀粉：結(jié)構(gòu)致密、顆粒較小薯類淀粉：結(jié)構(gòu)疏松，顆粒較大常用工業(yè)淀粉：玉米淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉（b）谷類（c）薯類b、淀粉質(zhì)原料（a）工業(yè)淀粉谷類淀粉：結(jié)構(gòu)致密、顆粒較小薯類1342、氮源物質(zhì)

a、提供合成細(xì)胞物質(zhì)所需氮素。（1）氮源物質(zhì)作用b、碳源不足時(shí)可為某些厭氧微生物提供能源c、如果目的產(chǎn)物有氮素存在要提供目的產(chǎn)物所需氮素。（2）氮源物質(zhì)黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉、蠶蛹粉、發(fā)酵菌絲、酒糟等。有機(jī)氮源：無(wú)機(jī)氮源：氨水、液氨、尿素、硝酸鹽、銨鹽2、氮源物質(zhì)a、提供合成細(xì)胞物質(zhì)所需氮素。（1）氮源135（3）工業(yè)上常用做氮源的蛋白質(zhì)類原料黃豆餅粉：抗生素玉米漿：用量0.4％－0.8％蛋白胨酵母粉蠶蛹粉：制霉菌素（3）工業(yè)上常用做氮源的蛋白質(zhì)類原料黃豆餅粉：抗生素玉米漿：1363、無(wú)機(jī)鹽（1）發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽a、磷酸鹽（a）作用I、提供某些蛋白質(zhì)、核酸、ADP、ATP所需磷元素II、緩沖作用（b）工業(yè)常用磷酸鹽K3PO4﹒3H2O、K3PO4、Na2HPO4﹒12H2O、NaH2PO4﹒2H2O3、無(wú)機(jī)鹽（1）發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽a、磷酸鹽（a）作用I、137b、硫酸鎂（a）作用I、提供酶的激活劑－鎂元素II、為菌體提供合成含硫蛋白的硫源（b）工業(yè)需要量MgSO4﹒7H2O：0.25～1g/Lb、硫酸鎂（a）作用I、提供酶的激活劑－鎂元素II、為菌體提138c、鉀鹽（a）作用I、維持細(xì)胞一定滲透壓和細(xì)胞透性II、是某些酶的激活劑（b）工業(yè)常用鉀鹽微生物需要鉀量以K2SO4計(jì)0.1g/L如果培養(yǎng)基磷酸鹽用K3PO4﹒3H2O或K3PO4鉀鹽就足夠。如用Na2HPO4﹒12H2O或NaH2PO4﹒2H2O需要配用0.3～0.6g/L的KClc、鉀鹽（a）作用I、維持細(xì)胞一定滲透壓和細(xì)胞透性II、是某139（2）培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度（2）培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度140能直接結(jié)合到產(chǎn)物中，而自身結(jié)構(gòu)沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物產(chǎn)量卻有較大提高。青霉素生產(chǎn)中，加入玉米漿，產(chǎn)量增加，原因是玉米漿含有苯乙胺，被優(yōu)先結(jié)合到青霉素分子中去。有些前體濃度過(guò)高時(shí)對(duì)菌體有毒性。此外，菌體還能分解前體，且前體相對(duì)價(jià)格較高，添加過(guò)多，容易引起揮發(fā)和氧化，因此常采用少量多次地加入。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量1364、前體能直接結(jié)合到產(chǎn)物中，而自身結(jié)構(gòu)沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物產(chǎn)量卻有1414、前體4、前體142促進(jìn)劑指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。例如：加巴比妥鹽能使利福霉素單位增加，并能使鏈霉菌推遲自溶，延長(zhǎng)分泌期。加酵母甘露聚糖可誘導(dǎo)甘露糖苷酶的產(chǎn)生，促使甘露糖鏈霉素轉(zhuǎn)化為鏈霉素?？刂粕锼氐募尤肓浚梢源龠M(jìn)谷氨酸從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外。加聚乙烯醇衍生物可防止菌絲結(jié)球，提高糖化酶的產(chǎn)量。5、促進(jìn)劑、抑制劑促進(jìn)劑5、促進(jìn)劑、抑制劑143抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產(chǎn)物，或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來(lái)。例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油，在發(fā)酵液中加入亞硫酸氫鈉，它與代謝中產(chǎn)生的乙醛生成加成物，使乙醇的產(chǎn)生受阻，亞硫酸鹽是乙醇代謝的抑制劑，促使甘油形成。溴化劑能抑制金霉素形成的代謝途徑，促使四環(huán)素的生成。5、促進(jìn)劑、抑制劑抑制劑5、促進(jìn)劑、抑制劑144大多數(shù)微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生產(chǎn)菌不能直接利用）。有些微生物能夠直接利用淀粉作原料，但必須在微生物產(chǎn)生淀粉酶后才能進(jìn)行，過(guò)程緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)。若直接利用淀粉作原料，滅菌過(guò)程的高溫會(huì)導(dǎo)致淀粉結(jié)塊，發(fā)酵液粘度劇增。因此，在發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須將淀粉水解為葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。在工業(yè)生產(chǎn)中，將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程稱淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。第二節(jié)淀粉水解糖的制備大多數(shù)微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生產(chǎn)菌不能直接利用145淀粉水解糖的制備方法及原理淀粉水解的過(guò)程淀粉吸水膨脹糊化α-淀粉酶

或酸液化

糊精糖化酶或酸低聚糖麥芽糖葡萄糖（由7-12個(gè)葡萄糖殘基組成）3-6個(gè)

2個(gè)1

淀粉水解糖的制備方法及原理146淀粉水解糖的制備方法及原理酸解法酶解法酸酶結(jié)合法原料：薯類、玉米、小麥、大米等原料淀粉的性質(zhì)和水解使用的催化劑的不同淀粉水解糖的制備方法及原理酸解法原料：薯類、玉米、小麥、大米147第二節(jié)淀粉水解糖的制備一、酸水解法酸水解法是以酸（無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法。1、酸水解法的原理淀粉在高溫加酸作用下，首先是顆粒結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，然后酸作用于α-1,4糖苷鍵及α-1,6糖苷鍵，使之?dāng)嗔眩馇罢叩乃俣纫煊诤笳?。第二?jié)淀粉水解糖的制備一、酸水解法酸水解法是以酸148水解過(guò)程：總反應(yīng)式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6過(guò)程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6淀粉糊精麥芽糖葡萄糖H+對(duì)作用點(diǎn)無(wú)選擇性，α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵均被切斷。水解過(guò)程：149H+對(duì)淀粉的糖苷鍵作用沒(méi)有一定順序，糖鏈的斷裂不規(guī)則，同時(shí)生成糊精，低聚糖，麥芽糖和葡萄糖。隨著水解進(jìn)行，葡萄糖，麥芽糖等還原性糖越來(lái)越多，當(dāng)葡萄糖值>60后，葡萄糖復(fù)合與分解反應(yīng)明顯，會(huì)產(chǎn)生其它有味物質(zhì)（如苦的龍膽二糖）以及色澤加深。H+對(duì)淀粉的糖苷鍵作用沒(méi)有一定順序，糖鏈的斷裂不規(guī)則，150

淀粉

葡萄糖復(fù)合二糖5－羥甲基糠醛復(fù)合低聚糖有機(jī)酸、有色物質(zhì)在淀粉的酸水解過(guò)程中，三種反應(yīng)同時(shí)發(fā)生復(fù)合反應(yīng)分解反應(yīng)鹽酸副反應(yīng)酸解法

151

不利影響：復(fù)合反應(yīng)：生成的多數(shù)復(fù)合糖不能被微生物利用，使發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)歉?。分解反?yīng)：生成的5－羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加了糖化液精制脫色的困難?？偅航档土似咸烟堑氖章?。給產(chǎn)物的提取和糖化液的精制帶來(lái)困難。酸解法不利影響：酸解法152如何控制分解反應(yīng)和復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生？

淀粉乳濃度

酸濃度

不能過(guò)高

溫度酸解法如何控制分解反應(yīng)和復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生？酸解法153工藝流程

原料（淀粉、水、鹽酸）→調(diào)漿→通蒸汽糖化→冷卻→中和（Na2CO3)、脫色（活性碳）→過(guò)濾除雜→糖液

2、淀粉酸水解法制糖的工藝過(guò)程（1）淀粉酸水解法工藝流程工藝流程

原料（淀粉、水、鹽酸）→調(diào)漿→通蒸汽糖化→冷卻154優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，設(shè)備周轉(zhuǎn)快。缺點(diǎn)：副產(chǎn)物多，影響糖液純度，一般DE值只有90％左右。對(duì)淀粉原料要求嚴(yán)格，不能用粗淀粉，只能用純度較高的精制淀粉。酸解法優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，設(shè)備周轉(zhuǎn)快。酸解法155DE值：dextroseequivalentvalue（葡萄糖當(dāng)量值）表示淀粉糖的含糖量。還原糖含量（％）DE值＝

100％干物質(zhì)含量（％）DE值DE值：dextroseequivalentvalueD1562、淀粉酸水解法制糖的工藝過(guò)程（2）淀粉酸水解法工藝條件的確定a、淀粉原料的選擇酸水解法對(duì)淀粉質(zhì)量要求較高b、無(wú)機(jī)酸的選擇和用量國(guó)內(nèi)普遍采用催化效能最高的鹽酸。用量為干淀粉的0.6％～0.7％。缺點(diǎn)：催化復(fù)合反應(yīng)的能力也大；對(duì)設(shè)備腐蝕較大；中和后產(chǎn)生氯化物，增加糖液鹽分2、淀粉酸水解法制糖的工藝過(guò)程（2）淀粉酸水解法工藝條件的確157b、無(wú)機(jī)酸的選擇和用量少數(shù)用硫酸。因運(yùn)輸存儲(chǔ)方便，價(jià)格低。缺點(diǎn)：需用碳酸鈣中和，中和時(shí)產(chǎn)生硫酸鈣，少部分不能過(guò)濾除去的易沉積在加熱管表面，影響傳熱。且糖液存儲(chǔ)時(shí)硫酸鈣慢慢沉淀造成糖液混濁。日本多用草酸。因用石灰中和后生成的草酸鈣不溶解，可以過(guò)濾除去。缺點(diǎn)：催化效能低，不夠經(jīng)濟(jì)。b、無(wú)機(jī)酸的選擇和用量少數(shù)用硫酸。因運(yùn)輸存儲(chǔ)方便，價(jià)格低。缺158c、水解的溫度與壓力靠控制壓力來(lái)控制加熱蒸氣的溫度。溫度越高水解速度越快，但同時(shí)復(fù)合與分解反應(yīng)也越快，且對(duì)設(shè)備腐蝕加強(qiáng)，對(duì)設(shè)備的耐壓性能要求高。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，宜控制在蒸氣壓力為0.28～0.32MPa（表壓）為好。c、水解的溫度與壓力靠控制壓力來(lái)控制加熱蒸氣的溫度。溫度越159d、淀粉乳濃度淀粉乳濃度高可保證發(fā)酵配料需要并可提高生產(chǎn)效率，但復(fù)合分解反應(yīng)多，糖液純度降低，色澤加深。易于水解的淀粉原料（薯類淀粉等）淀粉乳濃度要高些，不易于水解的淀粉原料（谷類淀粉等）淀粉乳濃度要低些。d、淀粉乳濃度淀粉乳濃度高可保證發(fā)酵配料需要并可提高生160e、糖化終點(diǎn)糖化時(shí)間過(guò)短水解不完全，糊精含量高，葡萄糖含量低，糖液質(zhì)量差，對(duì)發(fā)酵和產(chǎn)物提取都不利。糖化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)復(fù)合分解反應(yīng)強(qiáng)，復(fù)合糖多，色素增加，葡萄糖值也降低。糖化終點(diǎn)檢測(cè)：無(wú)水乙醇e、糖化終點(diǎn)糖化時(shí)間過(guò)短水解不完全，糊精含量高，葡萄糖含量161（3）糖化設(shè)備結(jié)構(gòu)對(duì)糖液質(zhì)量的影響（4）水解糖液的中和、脫色除雜a、中和（a）中和的作用I、除酸II、使蛋白質(zhì)等呈膠體狀態(tài)的雜質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)凝聚析出（b）用來(lái)中和的物質(zhì)I、純堿Na2CO3II、燒堿NaOH（3）糖化設(shè)備結(jié)構(gòu)對(duì)糖液質(zhì)量的影響（4）水解糖液的中和、脫色162b、脫色除雜（a）活性碳吸附法I、溫度一般控制在65℃II、pH控制在5.0以下III、時(shí)間25～30分鐘為好IV、活性碳用量控制在淀粉量的0.6％～0.8％b、脫色除雜（a）活性碳吸附法I、溫度一般控制在65℃II、163（c）中和注意事項(xiàng)I、pH終點(diǎn)控制（I）pH偏低雜質(zhì)不能最大量的凝聚析出（II）pH偏高分解反應(yīng)產(chǎn)生色素，部分凝聚物又重新溶解，造成過(guò)濾困難，泡沫增加。薯類淀粉原料所含蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較高，pH應(yīng)稍高些。玉米淀粉原料pH應(yīng)稍低些。II、溫度控制一般控制在60～70℃之間為宜。過(guò)高易生成焦糖，抑制某些生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)。過(guò)低也不行，后續(xù)的脫色除雜過(guò)濾需要一定的溫度。（c）中和注意事項(xiàng)I、pH終點(diǎn)控制（I）pH偏低雜質(zhì)不能最164（b）離子交換法I、優(yōu)點(diǎn)選擇性強(qiáng)，脫色效果好，便于管道化、連續(xù)化及自動(dòng)化操作，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度。II、缺點(diǎn)國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂質(zhì)量差，價(jià)格高（c）壓濾溫度一般控制在60～70℃（b）離子交換法I、優(yōu)點(diǎn)選擇性強(qiáng)，脫色效果好，便于管道165定義：

用專一性很強(qiáng)的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。二、（雙）酶水解法分兩步：（1）液化：用α-淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將糊精和低聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下進(jìn)行，又稱雙酶法。定義：二、（雙）酶水解法分兩步：166酶解法淀粉水解的過(guò)程淀粉吸水膨脹糊化（無(wú)化學(xué)反應(yīng)）α-淀粉酶

液化

糊精

糖化酶低聚糖糖化酶麥芽糖

葡萄糖（由7-12個(gè)葡萄糖殘基組成）3-6個(gè)2個(gè)1

酶解法167二、（雙）酶水解法1、α-淀粉酶/液化酶/糊精化酶內(nèi)切型淀粉酶，從淀粉分子內(nèi)部任意切開(kāi)α-1,4糖苷鍵，不能水解α-1,6糖苷鍵。水解速度受底物分子大小和結(jié)構(gòu)的影響，分子越小越難水解，分枝越多越難水解，離α-1,6糖苷鍵越近的鍵越難水解。（一）淀粉酶及其水解作用二、（雙）酶水解法1、α-淀粉酶/液化酶/糊精化酶內(nèi)1682、淀粉葡萄糖苷酶/糖化型淀粉酶/糖化酶外切型淀粉酶，從底物非還原性末端依次水解α-1,4糖苷鍵，也能水解α-1,6糖苷鍵，但較慢，速度僅是前者的十分之一。水解速度也受底物分子大小的影響，水解聚合度10～20的糊精時(shí)速度最快，水解淀粉和低聚糖速率較慢。水解能力隨不同微生物來(lái)源而異。2、淀粉葡萄糖苷酶/糖化型淀粉酶/糖化酶外切型淀粉酶169（二）淀粉的液化及液化終點(diǎn)的控制1、液化理論（1）淀粉的糊化a、定義淀粉顆粒由于受熱吸水膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失，變成糊狀液體，這種現(xiàn)