利用沼液培育能源微藻的研究

利用沼液培育能源微藻的研究

0微藻的生物質源由于能源安全和氣候變化的關注，生物燃料的開發(fā)和利用在全世界各國引起了高度重視。有從小麥、玉米等高糖作物,植物油或動物脂肪,來生產(chǎn)的第1代生物燃料,它在技術上來看很成熟,競爭優(yōu)勢顯著,但在中國并不鼓勵,因為它直接與糧食供應相沖突。第2代生物燃料中利用木質纖維素生產(chǎn)乙醇的成本與技術障礙制約了其發(fā)展速度;利用地溝油、煎炸廢油、高油作物來生產(chǎn)生物柴油的產(chǎn)量較低,遠不能滿足市場的需求。而微藻是具有很大潛力的可再生生物質資源。微藻生物質與其他陸生生物質資源相比,具有光合作用效率高、生長速度快、油脂含量高、不占耕地、產(chǎn)品附加值高等優(yōu)點。利用微藻累積的生物質,可為微藻轉化的能源形態(tài)提供原料。已有研究表明,微藻可以在污水中存活,利用污水中的有機養(yǎng)分進行異養(yǎng)生長,且通過光合作用吸收二氧化碳進行自養(yǎng)生長,利用污水培養(yǎng)微藻有利于環(huán)境治理,同時可以有效降低培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物成本投入。近年來中國大中型沼氣工程產(chǎn)生的大量沼液廢水,如何進行沼液處置的問題已經(jīng)引起人們的關注。沼液中因含有較高濃度的有機物,N、P等元素,完全具備為微藻提供養(yǎng)分的潛力,但是沼液成分復雜并含有大量微生物、細菌等,國內外雖有研究涉及沼液濃度及滅菌與否對培養(yǎng)微藻的影響,也有研究涉及培養(yǎng)液碳源、氮源優(yōu)化和其他環(huán)境因子的優(yōu)化,本試驗研究將在上述相關研究的基礎上,以7株被證明可以在污水中快速生長的微藻為研究對象,考察其在添加沼液培養(yǎng)液中的比生長速率、pH值和營養(yǎng)物的變化規(guī)律,以期為利用沼液培養(yǎng)能源微藻提供依據(jù)。1材料和方法1.1混合纖維濾膜的制備本研究中所用到的沼液取自北京市順義區(qū)北郎中集中供氣沼氣工程中心,沼液化學需氧量在950~1620mg/L,pH值約8.5,10000r/min離心后用孔徑0.45μm的混合纖維濾膜過濾,于-18℃冷凍備用。藻種為S496、1067、1069、C31、Y7、Y3和W,來源如表1所示。1.2美國戴安、陽離子的測試微量元素用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES,美國戴安)測試,陰離子用離子色譜儀(ICS-90,美國戴安)測試,陽離子用離子色譜儀(ICS-1500,美國戴安)測試。氨態(tài)氮用水楊酸分光光度法(GB7481-1987)測試。1.3培養(yǎng)液和水泥砂膠藻種采用BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng),配方見表2,試驗藥品均為分析純。培養(yǎng)溫度(25±1)℃,光照強度8000lx,光暗比(L:D)為14:10。選取對數(shù)期的藻種接種。試驗采用100mL三角瓶,裝60mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為沼液與BG11的混合液,其中沼液所占體積約為10%,控制680nm吸收波長下初始光密度(opticaldensity,OD)為0.1~0.2,將S496、1067、1069、C31、Y7、Y3和W藻株分別接入培養(yǎng)液中,每組設3個重復。溫度(25±1)℃,光照強度8000lx,光暗比(L:D)為14:10。手動搖勻,每天搖6次,以防止藻沉淀或附著于瓶壁。連續(xù)培養(yǎng)12d,每2d測定培養(yǎng)液OD680、pH值,并且測定培養(yǎng)前后的培養(yǎng)液成分變化。1.4生長曲線方程的繪制生物量測定方法采用比濁法和干質量法。比濁法:用紫外可見分光光度計(型號GoldS54T,上海棱光公司)測定680nm吸收波長下的光密度(OpticalDensity,OD);干質量法:取培養(yǎng)12d的培養(yǎng)液25mL,離心,去離子水清洗后,用已在75℃干燥箱中烘5h的1.2μm孔徑玻璃纖維濾紙(型號GF/C,Whatman,英國)過濾,然后在75℃干燥箱中烘5h測得干質量(DW)。生長曲線中,選取不同培養(yǎng)時間的適宜培養(yǎng)液,以OD為自變量,DW為因變量進行線形擬合,得到藻“干質量-光密度”標準曲線方程。藻類生長一般經(jīng)歷適應期、指數(shù)生長期、衰減期、穩(wěn)定期和死亡期5個階段。指數(shù)期的比生長速率R(d-1)的計算公式如(1)式所示。式中,Nt1,Nt2表示t1和t2時刻的藻干質量,g/L。培養(yǎng)液pH值由pH儀(型號5-star,德國Orion公司)測定。2結果與分析2.1沼液原液的成分如表3所示,沼液中包含了BG11培養(yǎng)液的大部分元素,包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、Cu、Fe、Co、Mn、NH4-N、NO3-。沼液原液的成分基本能滿足藻生長的需要,與BG11相比,沼液中的氮主要以氨態(tài)氮形式存在,而BG11中的是硝態(tài)氮;沼液中的P、Zn、Fe和Mn含量較少或沒有;沼液中還含有F-、NO2-;沼液中并未發(fā)現(xiàn)重金屬Pb、Cr和Cd。用BG11與沼液混合來培養(yǎng)微藻,不僅可以達到稀釋沼液的目的,而且能保證培養(yǎng)液營養(yǎng)元素的種類均衡完備,對沼液處置有利。通過表3還可以看出,混合沼液的營養(yǎng)液成分發(fā)生改變,如Na+、Fe、Mn、PO43-、NO3-減少。2.2適應沼液濃度根據(jù)表4藻干質量和光密度之間的線性關系(R2>0.997),可計算藻干質量。藻株經(jīng)過7d約含10%體積沼液廢水的馴化后,大部分藻均能適應含沼液體積分數(shù)為10%的培養(yǎng)液。如圖1,除了Y7,其它6株藻均能迅速適應本試驗濃度,迅速進入對數(shù)期生長。在第10天,1067先于其它進入穩(wěn)定期,可能由于沼液添加濃度偏高,導致其他6株培養(yǎng)了12d還未進入穩(wěn)定期。從圖1明顯可以看出,Y7對BG11培養(yǎng)基混加體積分數(shù)10%沼液培養(yǎng)液的濃度或起始pH值9.32并不適應,與其他各株相比生長速度一直處于落后。2.3沼液中ph值的變化由圖2知,7株藻所在培養(yǎng)液在培養(yǎng)的前2d,pH值均有所下降,C31、Y7、W的下降持續(xù)到第4天,從9.20~9.32下降至8.73~9.09,之后才開始上升。(由式(1)計算得出比生長速率)在pH值下降的同時,藻的比生長速率增大;對于藻株Y7、WpH值降到最低時,藻比生長速率達到最大值,其他藻株延遲2d后達到最大值。沼液中氮的形態(tài)主要是氨態(tài)氮,并且藻類在環(huán)境中具有多種形態(tài)氮時,較優(yōu)先利用氨態(tài)氮,而藻細胞利用氨分子,使得培養(yǎng)液中H+濃度增加,這是pH值在培養(yǎng)前期下降的原因,隨著沼液中有機酸徹底降解、硫酸鹽的還原或利用硝態(tài)氮引起pH值上升,有些藻株如1067、1069、Y3在pH值上升后再下降,分析原因是可能有酸性分泌物產(chǎn)生;藻株C31氨態(tài)氮消耗殆盡,但硝態(tài)氮利用有限(見表5),pH波動不大;藻株W在pH值上升后下降而后有緩慢上升,原因可能是酸性分泌物不穩(wěn)定。2.4藻體生長速率如表5所示,培養(yǎng)前后,培養(yǎng)液中的Na+、K+濃度有升有降,這可能由于培養(yǎng)12d水分蒸發(fā)和藻光合作用消耗水分,而藻類對這些元素吸收有限的緣故。有研究表明,當環(huán)境中存在氨態(tài)氮時,藻優(yōu)先利用氨態(tài)氮。1067藻株平均比生長速率最大,對培養(yǎng)液中的氨態(tài)氮消耗至微量,而后再以硝態(tài)氮為氮源進一步利用,因此導致NO3-濃度的降低。NH4-N、Mg2+、SO42-、Mn、F-、Fe的濃度均顯著下降,NH4-N、Mn、Fe幾乎被完全消耗;Mg2+降幅為11.47%~87.73%;SO42-為37.30%~62.70%;F-為18.18%~54.55%。說明此類物質是藻類能大量吸收即生長所必需的。Cl-被藻株吸收23.33%~32.82%(除S469與W);Ca2+下降幅度為7.80%~19.72%(除1067)。本研究中Fe最終被完全消耗。在含F(xiàn)e培養(yǎng)液中培養(yǎng)的藻細胞濃度比在不含F(xiàn)e培養(yǎng)液中培養(yǎng)的高,微量的Fe對藻生長有利。2.5不同環(huán)境中生物多樣性對微藻生長的影響培養(yǎng)12d后,S496、1067、1069、C31、Y7、Y3、W7株藻的干質量累積質量濃度(培養(yǎng)第12天與起始接種量的差值)分別累積了0.540、0.571、0.607、0.347、0.310、0.559、0.543g/L,其中1069的最大,其次是1067、Y3和W(如圖3)。本研究中得到的生物產(chǎn)量并不是目前研究中最高的,這可能是因為培養(yǎng)液中初始含磷量甚微(PO43-最大質量濃度為0.14mg/L)。對于淡水浮游植物而言,當環(huán)境中的N:P摩爾比大于20:1時,具有磷限制性,小于10:1時,具有氮限制性。在本研究中出現(xiàn)磷限制,導致微藻細胞分裂難以進行,因而藻生長受到抑制。另外,沒有對培養(yǎng)液pH值進行調節(jié),影響了微藻生長;沒有補充外加碳源如無機碳CO2有機碳冰醋酸等,可能造成C/N比偏低,碳源受限影響了藻的生物量累積。3混合培養(yǎng)基的生長特性本文利用體積分數(shù)10%的沼液與BG11培養(yǎng)基的混合液分別培養(yǎng)Chlorellasp.等7株微藻,研究比較各株微藻的比生長速率、pH值、營養(yǎng)成分變化規(guī)律及干質量累積量,為開辟非糧作物生物質能源原料提供依據(jù)。主要得到以下結論:1)在本試驗中,沼液中的P、Zn、Fe和Mn含量較少或沒有。因此,用BG11培養(yǎng)基與沼液混合來培養(yǎng)微藻,不僅可以達到稀釋沼液的目的,而且能保證營養(yǎng)元素的種類完備。S496、1067、1069、C31、Y7、Y3、W7株藻,除Y7,其它6株均能很好適應本試驗中沼液的濃度,迅速進入對數(shù)期生長,1067先于其它藻株進入穩(wěn)定期。2)培養(yǎng)過程中,未調節(jié)培養(yǎng)液pH值條件下,所有的培養(yǎng)液在前2~4dpH值均下降,之后pH值開始上升。pH值下降的同時,藻的比生長速率增大的趨勢;對于藻株Y7、WpH值降到最低時,