農(nóng)學(xué)動(dòng)物生物化學(xué)課件13 DNA的生物合成-復(fù)制

第13章DNA的生物合成

—復(fù)制（Replication）第13章DNA的生物合成1本章主要內(nèi)容：

中心法則

DNA復(fù)制的半保留性參與DNA復(fù)制的酶類和蛋白因子

DNA的復(fù)制過程

DNA的損傷和修復(fù)

反轉(zhuǎn)錄本章主要內(nèi)容： DNA復(fù)制的半保留性DNA的復(fù)制過程2

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)--在生命有機(jī)體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠(yuǎn)存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動(dòng)遵循著中心法則。1.中心法則 現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)--從DNA到蛋32.DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semiconservativereplication)： 復(fù)制時(shí)，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，然后各自作為模板指導(dǎo)合成新的互補(bǔ)鏈。

所形成的兩個(gè)子代DNA分子與親代DNA分子堿基順序完全相同—復(fù)制。每個(gè)子代DNA分子中的一條鏈來自親代，另一條鏈為新合成的—半保留。2.DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semiconserva42.DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)1958年M.Messelson等用實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)雙螺旋結(jié)構(gòu)是半保留復(fù)制的分子基礎(chǔ)2.DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)1958年M.Me5半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親6復(fù)制DNA的生物合成逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制（replication）：即DNA的生物合成，以親代DNA為模板合成兩個(gè)完全相同的子代DNA分子的過程。復(fù)制DNA的生物合成逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制（replication）：即7復(fù)制的反應(yīng)

dATPdCTPdGTP dTTPDNA聚合酶

DNA模板DNA+（

n1+n2+n3+n4)PPiPPi隨即被焦磷酸酶水解，從而推動(dòng)聚合反應(yīng)的進(jìn)行。

DNA復(fù)制是在酶的催化下的脫氧核苷酸聚合 過程。需要4種dNTP為底物外，還需要多種酶、 蛋白因子、親代DNA單鏈模板及RNA引物。復(fù)制的反應(yīng)dCTPDNA聚合酶DNA+（PPi隨即被焦磷酸83.DNA的復(fù)制過程3.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子

原核生物：以大腸桿菌為例1.原料：4種dNTP2.解開成單鏈的DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’-OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物3.DNA的復(fù)制過程3.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子1.原95.DnaA蛋白，與復(fù)制起始部位上（OriC）特定的序列結(jié)合。E.Coli上固定的復(fù)制起始點(diǎn)稱為Ori.C5.DnaA蛋白，與復(fù)制起始部位上（OriC）特定的序106.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋白）：由多種蛋白因子協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)上解開雙螺旋。7.單鏈結(jié)合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）：穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復(fù)性。6.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋118.拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）拓?fù)湟辉~的含義是指物體或圖象做彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的現(xiàn)象。拓?fù)洚悩?gòu)酶可松弛正超螺旋，還可引入負(fù)超螺旋，有利于復(fù)制叉的行進(jìn)及DNA的合成。I型酶II型酶8.拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）拓?fù)湟辉~12DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解鏈后DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoiSOmerase）108局139.DNA聚合酶（DNApolymerase）全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DNA-pol或DDDP）DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶：9.DNA聚合酶（DNApolymerase）全稱：依賴14聚合酶I：用于切除引物RNA,并填補(bǔ)留下的空隙5’→3’

聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈3’→5’

外切酶的作用，切除可能錯(cuò)配的核苷酸5’→3’外切酶的作用是切除引物聚合酶I：用于切除引物RNA,并填補(bǔ)留下的空隙5’→3’15小片段

323個(gè)氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶小片段 323個(gè)氨基酸大片段/Klenow片段 60416聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈3’→5’核酸外切酶活性聚合酶III：主要的復(fù)制酶，并有校讀、糾錯(cuò)的功能

5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈，活性很強(qiáng)，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，將原料dNTP與游離的3’-OH上連接，同時(shí)釋出一個(gè)PPi。

3’→5’核酸外切酶活性，切除可能錯(cuò)配的核苷酸聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈聚17DNA-polIII:

由10種亞基組成的不對稱聚合體

催化效率最高其中α亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3'→5'外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。φεεDNA-polIII:由10種亞基組成的不對稱聚合體18[農(nóng)學(xué)]動(dòng)物生物化學(xué)課件13DNA的生物合成—復(fù)制19負(fù)責(zé)鏈的延長

(活性高)＋＋

切去引物物RNA，補(bǔ)上 正確的的DNA片段與修復(fù)有關(guān)(活性低)＋＋＋＋＋DNA聚合 酶ⅠDNA聚合 酶Ⅱ原核生物DNA聚合 酶Ⅲ5'→3'3'→5'核酸外切核酸外切聚合功能DNA聚合酶5'→3'大腸桿菌3種DNA聚合酶的性質(zhì)比較

催化活性負(fù)責(zé)鏈的延長＋＋ 切去引物物RNA，補(bǔ)上＋＋＋DNA聚合原物20真核生物的DNA聚合酶

在復(fù)制延長中起催化作用在沒有其他DNA-pol時(shí)才發(fā)揮催化作用 在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用在復(fù)制延長中起催化作用 在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺 口的作用DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶 在復(fù)制延長中起催化作用DNA-2110.DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP10.DNA連接酶（ligase） 將不連續(xù)的DNA片段以22SM哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成(synthesis)期

G1分為起始、延長、終止三個(gè)階段3.DNA的復(fù)制過程

G2SM哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成(synthesis)期23聚合反應(yīng)的特點(diǎn)：1、聚合反應(yīng)具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3

-OH逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長。3.DNA的復(fù)制過程聚合反應(yīng)的特點(diǎn)：1、聚合反應(yīng)具有方向性:5324DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈總是5’→3’方向聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈總是5’→3’方向聚合酶催化的鏈延25相關(guān)的幾個(gè)概念：1、復(fù)制起始點(diǎn)（E.coli-OriC）

復(fù)制從特定的位點(diǎn)開始，這一位置叫復(fù)制原點(diǎn)。原核生物的DNA上一般只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，但在迅速生長時(shí)期，第一輪復(fù)制尚未完成，就在起點(diǎn)處啟動(dòng)第二輪復(fù)制。真核生物則有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，可以同時(shí)啟動(dòng)復(fù)制過程。相關(guān)的幾個(gè)概念：1、復(fù)制起始點(diǎn)（E.coli-OriC） 復(fù)26

5

3

新鏈3

5

3

2、復(fù)制叉（replicationfork）

復(fù)制時(shí)DNA雙鏈解開分成二股單鏈，新鏈沿 著張開的二股單鏈生成，復(fù)制中形成的這種Y字形 的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。

5

3

5

親代DNA

復(fù)制方向 5新鏈32、復(fù)制叉（replicationfork）27A放射自顯影圖像orioriori復(fù)制示意B圖

θ形

3、雙向復(fù)制

原核生物例如E.coli，是從固定的復(fù)制起始點(diǎn)開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，稱為雙向復(fù)制。A放射自顯影圖像orioriori復(fù)制示意B θ 3、雙向復(fù)28復(fù)制起始點(diǎn)真核原核

復(fù)制叉復(fù)制起始點(diǎn)真核原核293.DNA的復(fù)制過程

3.2DNA復(fù)制過程

3.2.1復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1、DNA解開成單鏈，提供模板2、合成引物，提供3

-OH末端3.DNA的復(fù)制過程需要解決兩個(gè)問題：1、DNA解開成單鏈30DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn),形成起始復(fù)合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白協(xié)助DnaB★在多種蛋白質(zhì)參與下，DNA雙螺旋解開，形成單鏈SSB維持單鏈穩(wěn)定DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn),形成起始復(fù)合物DnaB蛋白解螺旋Dn31OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB5

3

3

5

OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚?2總結(jié)：

①復(fù)制的起始在原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)（Ori.C），而在真核生物有多個(gè)起始點(diǎn)。②DnaA，DnaB（解螺旋酶，rep蛋白）和DnaC參與解鏈，形成復(fù)制叉（replicationfork），SSB結(jié)合并穩(wěn)定解開的單股DNA鏈；引物酶（DnaG）與上述因子、酶構(gòu)成引發(fā)體（primosome），并合成RNA引物。解鏈造成的超螺旋，由拓?fù)洚悩?gòu)酶實(shí)現(xiàn)超螺旋的轉(zhuǎn)型，即把正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。總結(jié)： ①復(fù)制的起始在原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)②DnaA，33辨認(rèn)功能起始點(diǎn)并結(jié)合于位點(diǎn)解開DNA雙鏈協(xié)助解螺旋酶催化RNA引物生成穩(wěn)定解開的單鏈理順DNA鏈E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)名稱DnaA蛋白(四聚體)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）DnaC蛋白引物酶（DnaG蛋白）SSB拓?fù)洚悩?gòu)酶oriC（245bp的DNA組分）參與復(fù)制起始的各種因子和酶辨認(rèn)功能起始點(diǎn)并結(jié)合于位點(diǎn)名稱參與復(fù)制起始的各種因子和酶34原核生物復(fù)制的起始原355’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-poldGTPdTTPdCTP dTTP

dATPdGTPdATPdCTP3.2.2DNA鏈的延伸

DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合 到新鏈3’末端，使其不斷延長。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDN36半不連續(xù)復(fù)制示意圖半不連續(xù)復(fù)制示意圖37這種前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的方式，稱為半不連續(xù)復(fù)制。

隨后鏈中合成的多個(gè)DNA片段，稱為岡崎片段。岡崎片段的長度原核細(xì)胞中約1000-2000個(gè)核苷酸，真核細(xì)胞中約100-200個(gè)核苷酸。這種前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的方式，稱為半不連續(xù)復(fù)制。38復(fù)制叉的推進(jìn)①先導(dǎo)鏈的合成引物酶在復(fù)制原點(diǎn)附近合成一段RNA引物；DNA聚合酶Ⅲ(原核細(xì)胞)在引物的3'末端逐個(gè)添加脫氧核苷酸。隨著復(fù)制叉的推進(jìn)，親代DNA雙螺旋不斷被解開，先導(dǎo)鏈也不斷延伸。復(fù)制叉的推進(jìn)①先導(dǎo)鏈的合成引物酶在復(fù)制原點(diǎn)附近合成一段R39②隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個(gè)岡崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。岡崎片段的合成：DNA聚合酶Ⅲ(原核細(xì)胞)在引物的3'末端使DNA鏈延伸，直至抵達(dá)其下游的另一個(gè)岡崎片段的RNA引物的5'端。岡崎片段的連結(jié)：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游岡崎片段的3'-OH末端添加脫氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至將引物全部切除。DNA連接酶將最后的缺口補(bǔ)好。②隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個(gè)岡崎片段都需要合成40③先導(dǎo)鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個(gè)DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚體催化隨后鏈的模板回折成環(huán)，從而使岡崎片段的延伸方向與先導(dǎo)鏈的延伸方向一致，它們的3'末端分別落在DNA聚合酶Ⅲ全酶的雙活性部位。因此，隨著聚合酶的移動(dòng)，兩條鏈同時(shí)延伸。③先導(dǎo)鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個(gè)DNA聚合隨后鏈的模41復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)42

由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化在真核線性DNA的末段形成一種特殊的結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)結(jié)合成端粒（telomere）。3.2.3復(fù)制的終止 由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)在真核生物，由端粒酶43

連接酶將DNA片段連接起來完成復(fù)制DNA聚合酶I正在一邊切除RNA引物，一邊合成新的DNA以填補(bǔ)空隙引物岡崎片段 連接酶將DNA片段DNA聚合酶I正在一邊引物岡崎片段44大腸桿菌DNA的復(fù)制大腸桿菌DNA的復(fù)制45至少依賴三種機(jī)制1、遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律。聚合酶在復(fù)制 延長中對堿基的選擇功能（按模板要求選 擇底物）。2、復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)的校讀功能3、切除引物4、聚合時(shí)的方向5、修復(fù)作用★復(fù)制忠實(shí)性的保證至少依賴三種機(jī)制1、遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律。聚合酶在復(fù)制2、46聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)47胸腺嘧啶二聚體

DNA的突變有點(diǎn)突變（堿基的錯(cuò)配）、堿基的缺失、DNA片段的重排等形式。4.DNA的損傷與修復(fù)

4.1DNA的損傷

DNA的突變(損傷)大多數(shù)是 自發(fā)的，是進(jìn)化與分化的基礎(chǔ)。 環(huán)境中的理化因素，如紫外 輻射引起兩個(gè)嘧啶堿基的共價(jià) 聚合。許多化學(xué)誘變劑，它們 常是致癌物,如亞硝酸鹽，常 導(dǎo)致DNA突變。胸腺嘧啶二聚體 DNA的突變有點(diǎn)突變（堿基4.DNA的損傷48直接修復(fù)：如光復(fù)活酶,普遍存在在生物機(jī)體中,可以把嘧啶二聚體恢復(fù)正常狀態(tài)。切除修復(fù)：找出損傷位置并切除，進(jìn)行修復(fù)合成并連接。重組修復(fù)：先復(fù)制再修復(fù)。子代鏈在對應(yīng)模板鏈的損傷處留下 缺口，先將同源母鏈DNA上相應(yīng)的核苷酸片段轉(zhuǎn)移替補(bǔ)， 然后再合成一段序列填充缺口。SOS系統(tǒng)：復(fù)雜的應(yīng)急反應(yīng)。既有避免差錯(cuò)的修復(fù)又有引起差錯(cuò)的修復(fù)，后者有高變異率但也增加了生存機(jī)會(huì)。4.DNA的損傷與修復(fù)4.2DNA損傷的修復(fù)直接修復(fù)：如光復(fù)活酶,普遍存在在生物機(jī)體中,可以把嘧啶二聚體49

重組修復(fù)切除修復(fù) 重組修復(fù)50逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)以RNA為模板，合成與其互補(bǔ)的DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶5.逆轉(zhuǎn)錄作用—以RNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)51

逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，是某些生物（如雞的肉瘤病毒、HIV等）的特殊復(fù)制方式。它們的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。因此，在感染細(xì)胞時(shí)，首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用成為雙鏈DNA，才能整合到宿主基因組中去。 這個(gè)過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化，它具有以RNA為模板合成DNA，水解雜交鏈上的RNA以及以DNA為模板合成DNA三種活性。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）（H.Temin，1970）是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對經(jīng)典中心法則重 逆轉(zhuǎn)錄也稱反轉(zhuǎn)錄，式。它們的遺傳信息載體是RNA而不是DN52RNADNA以RNA為模板，合成DNA的過程。

反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶有三個(gè)作用 以RNA為模板合成DNA(cDNA） 水解RNA模板第二以新合成單鏈DNA為模板合成條DNARNADNA以RNA為模板，合成DNA的過程。反轉(zhuǎn)錄酶有三53逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：

RNA模板

逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA-RNA

雜化雙鏈

RNA酶

單