堿性磷酸酶km實驗報告

竭誠為您提供優(yōu)質(zhì)文檔/雙擊可除堿性磷酸酶km實驗報告篇一：堿性磷酸酶Km值得測定(1)堿性磷酸酶Km值得測定原理在適宜條件下，酶促反應的初速度隨底物濃度【s】增大而增大，當?shù)孜餄舛冗_一定時則反應趨于穩(wěn)定，反應速度最大。關系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常數(shù)。將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程對1/s作圖可算出Km步驟，以1/V結(jié)果由y=9.2961x+1.1465算出當y=0時x=-0.233，繼而算出Km值=8.11mmol/L討論計算出來的Km值與查資料所得到的值有一定的差距。1 8誤差，所以導致與實際值差距較大。尿蛋白定性檢測原加熱可以使蛋白質(zhì)變性溶液ph等于pI時溶解度最小。步驟1.取大試管一支，加入5ml澄清尿液。2.用試管夾持試管上端，酒精燈加熱尿液斜面至沸(堿性磷酸酶km實驗報告)3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面輕輕混勻局部加熱。結(jié)果未加熱部分是澄清，加熱部分渾濁明顯討正常尿液中不會出現(xiàn)渾濁，本實驗尿液加入了蛋白質(zhì)。尿液中如果出現(xiàn)沉淀則說明出現(xiàn)了病癥。分子篩層析（凝膠過濾法）原理大分子先出，小分子后出。步驟1.取5~8滴4mg/ml藍色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重鉻酸鉀液混勻。2 82.將層析柱出水口打開，緩放柱內(nèi)液體至凝膠柱表面加入混勻的待層析液。3.從上成2~3cm高水4.在上口加洗脫液洗脫。每支小試管接1cm5.觀察不同小試管的液體顏色的變化。結(jié)果討論分子篩層析能夠大致的分離分子量不同的物質(zhì)，但是分離的物質(zhì)不純有雜質(zhì)，實驗時間也相對較長，操作復雜。篇二：實驗名稱堿性磷酸酶的分離純化實驗報告實驗名稱堿性磷酸酶的分離純化、比活性測定與動力學分析實驗日期20XX年10月25號實驗地點生化實驗室合作者指導老師總分教師簽名批改日期堿性磷酸酶（AKp或ALp）是一種底物特異性較低，在堿性條件下能水解多重磷酸單脂化合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。AKp具有磷酸基團轉(zhuǎn)移活性，能將底物中的磷受體是水則其作用就是水解AKp最適ＰＨ范圍為８.６－１０，動物中AKp主要存在于小腸粘膜、腎、骨骼、肝臟和3 8胎盤等組織的細胞膜上。血清AKp主要來自肝，小部分來自骨骼。AKp可從組織中分離純化，也可以采用基因工程表達的方式獲得：將堿性磷酸酶基因克隆到重組載體，轉(zhuǎn)入宿主菌中進行重組表達，并從表達菌提取，并進行酶動力學分析。一實驗原理1、堿性磷酸酶的分離純化AKp分離純化的方法與一般蛋白質(zhì)的分離純化方法相似，分離AKp。正丁醇能使部分雜蛋白變性，過濾除去雜蛋白即為含有AKp的濾液，AKp能溶于終濃度為33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于終濃度為50%的丙酮或60%的乙醇中，通過離心即可得到初步純化的AKp。2、堿性磷酸酶的比活性測定根據(jù)國際酶學委員會規(guī)定，酶的比活性用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性來表示，單位（u/mg?pr）來表示。因此，測定樣品的比活性必須測定a每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)；b每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。酶的純濃度越高酶的比活性也就越高。本實驗以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解生成游離酚和磷酸鹽酚在堿性條件下與4-氨基安4 8淺和酚的含量成正比。于510nm處比色，即可求出反應過程中產(chǎn)生的酚含量而堿性磷酸酶的活性單位可定義為在37攝氏度保溫15min每產(chǎn)生1mg的單位。品蛋白質(zhì)含量測定用Folin-酚法測定。3、底物濃度對堿性磷酸酶活性的影響在環(huán)境的溫度、ＰＨ和酶的濃度一定時，酶促反應速度（Vmax程式表示：式中Vmax為最大反應速度[s]為底物濃度Km為米氏常數(shù)V代表反應的起始速度①當ν=Vmax/2時Km=[s]。因此Km等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。②Km是酶的最重要的特征性常數(shù)，測定Km值是研究酶動力學的一種重要的方法，大多數(shù)酶的Km值在0.01-100mmol/L。③Km和Vmax的測5 8用Lineweaver-burk雙倒數(shù)作圖法。此式為直線方程，以不同的底物濃度1/s坐標，以1/V將各點連成一直線，向縱軸方向延長，此線與橫軸相交的負截距為-1/Km，由此可以正確球的該酶的Km值。方程式與圖如下：本實驗以堿性磷酸酶為例，測定不同底物濃度時的酶活性，再根據(jù)Lineweaver-burk法作圖計算其Km值。實驗以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用鉀氧化生成紅色的醌衍生物上差得酚的含量，進而算出酶活性的大小。二、實驗材料（一）堿性磷酸酶的分解純化和比活性測定１、樣品兔肝２、試劑①0.5mol/L乙酸鎂溶液②0.1mol/L乙酸鈉溶液③0.01mol/L乙酸鎂0.01mol/L乙酸鈉溶液④0.01mol/LTris－0.L乙酸鎂ph８.８緩沖液⑤丙酮（分析純）⑥95%乙醇（分析純）⑦正丁醇（分析純）⑧0.04mol/L１mg/ml分標準液⑩0.5mol/LＮａＯ6 8?0.3%4－氨基安替比?0.5%鐵氰化鉀?0.1mg/mL蛋白標準液?堿性銅試劑?酚試劑３、儀器與器材①研缽②刻度離心管③刻度吸管④電動離心機⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盤天平⑦恒溫水浴⑧可見分光光度計（二）底物濃度對堿性磷酸酶活性的影響１、樣品兔肝勻漿液２、試劑①0.04mol/L底物液②0.1mol/L碳酸鹽緩沖液ph10（37℃）③堿性溶液④0.5%鐵氰化鉀0.3%4－氨基安替比林⑥酚標準液（0.1mg/ml）３、儀器與器材①恒溫水浴鍋②可見光分光光度計三、實驗步驟（一）AKp的提取AKp提取實驗步驟(二)AKp的比活性測定1、AKp的活性測定7 8AKp活性測定實驗步驟2、蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定實