植物基因工程中的常用啟動子

植物基因工程中的常用啟動子_3231植物基因工程中的常用啟動子_3231植物基因工程中的常用啟動子植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式及功能可分為三類：組成型啟動子(constitutivepromoter)、誘導(dǎo)型啟動子(induciblepromoter)和組織特異性啟動子(tissue-specificpromoter)。這種分類大體上反映了它們各自的特點,但在某些情況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性。1組成型啟動子組成型啟動子在所有組織中都啟動基因表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定的。它包括異源和內(nèi)源組成型啟動子兩類。植物基因工程中應(yīng)用的異源組成型啟動子主要有CaMV35S啟動子(來源于煙草花葉病毒基因)，能在大部分植物中對異源基因進行啟動表達，完整的CaMV35S啟動子是植物基因工程中應(yīng)用最為廣泛的組成型啟動子之一，如在馬鈴薯、擬南芥、煙草、蘑菇、毛白楊等植物中的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。常用的還有來自農(nóng)桿菌的Nos和Ocs啟動子。內(nèi)源啟動子主要有水稻肌動蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的啟動子，這些啟動子可以更有效地驅(qū)動外源基因在單子葉植物中的表達。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶8亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動子，用其代替CaMV35S啟動子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也取得了很好的表達效果。用這些啟動子代替CaMV35S啟動子，可以更有效地在單子葉植物中驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。組成型啟動子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于雙子葉植物、單子葉植物以及真菌等的基因工程中。但是由于組成型啟動子驅(qū)動的基因在植物各組織中均有表達，應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題。例如外源基因在整株植物中表達，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導(dǎo)致死亡(karlowakietal.,2003;Ehasanietal.,2003;Miyaoetal.,2003)。另外，重復(fù)使用同一種啟動子驅(qū)動兩個或兩個以上的外卜源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象(Kumpatlaetal.,1998)，因此，人們尋找更為有效的組織、器官特異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調(diào)控植物基因表達。2特異性啟動子特異性啟動子可分為兩類，一是受誘導(dǎo)表達的啟動子，能對外界的物質(zhì)如病原物、化學(xué)物質(zhì)或逆境作出反應(yīng)，啟動植物體內(nèi)相應(yīng)的生理生化過程。二是組織特異表達的啟動子，使基因在特定的組織中表達。特異性啟動子避免了基因過量表達對植物體的傷害，同時可避免外源基因在食用部位表達，解決了食品安全性問題。特異性啟動子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達外源基因奠定了基礎(chǔ)。(1)誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)型啟動子在某些物理或化學(xué)信號的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。他們有以下共同特點：?[3][4][5]啟動子的活化受物理或化學(xué)信號的誘導(dǎo)；？具增強子、沉默子或類似功能的序列結(jié)構(gòu)；？感受特異性誘導(dǎo)的序列都有明顯的專一性；？一部分該類型的啟動子同時具組織特異性表達的特點；？該類啟動子常以誘導(dǎo)信號命名，可分為光誘導(dǎo)表達基因啟動子，如rbcS、cab基因啟動子；熱誘導(dǎo)表達基因啟動子如大豆的Gmhsp17。3-B啟動子；創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達基因啟動子如水稻的RCH8啟動子；激素誘導(dǎo)表達基因啟動子如綠豆的VR-ACS6啟動子；真菌和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達基因啟動子如馬鈴薯P69B啟動子等(王關(guān)林和方宏筠，1998)。(2)組織特異性啟動子組織特異性啟動子的調(diào)控機制目前已進行了深入的研究，基因的上游存在著調(diào)控序列，啟動子除具有一般的結(jié)構(gòu)外，通常還有一些調(diào)控特異表達的元件。在組織特異性啟動子調(diào)控下，基因的表達通常只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。根特異性啟動子的研究Keller等1989年分離了來自煙草的富含羥脯氨酸的糖蛋白hrgp基因，這個基因所編碼的蛋白用來強化新形成側(cè)根的細(xì)胞壁，在根中特異表達；Keller等1991年又發(fā)現(xiàn)一個法國菜豆胞壁蛋白基因富含甘氨酸蛋白grp基因啟動子是根管束組織特異表達的，在其-96上一頁[3][4][5]?-76bp處有一個特異性表達元件負(fù)責(zé)根尖膨大維管分化區(qū)組織帶中的主要表達。莖桿和葉片特異性啟動子的研究Kyozuka等(1993)研究了水稻和番茄的rbcS基因啟動子在水稻中的啟動活性，證明了它們都能驅(qū)動gus基因在葉片和莖桿中特異表達。IrisMeier等（1995）研究番茄rbcS基因家族也發(fā)現(xiàn)rbcS3A在葉片和莖桿中特異表達。Sheng等研究水稻cab基因啟動子，證明了cab基因啟動子僅在綠色組織中啟動活性。大多數(shù)葉片和莖桿特異的啟動子同時也是受光誘導(dǎo)的啟動子。生殖器官特異性啟動子的研究Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達基因啟動子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseT融合后轉(zhuǎn)化植物核酸酶基因在花藥中特異表達，破壞絨氈層，獲得雄性不育煙草和油菜，開創(chuàng)了基因工程創(chuàng)造雄性不育系的先河，至今已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上獲得成功。Annadana等克隆了菊花UEP1啟動子并與4個異源啟動子（矮牽牛的chs2A和EPF225,擬南芥的CER6以及馬鈴薯的PMC）比較發(fā)現(xiàn)：UEP1啟動子在傘形花序和花盤小花的花瓣中表達量最高，緊接著是CER6上一頁[3][4][5]和EPF225啟動子，在傘形花序小花中UEP1啟動子的表達量是CaMV35S啟動子的50倍。維管束特異性啟動子的研究目前發(fā)現(xiàn)的能夠定位于維管組織的啟動子根據(jù)其來源基本可以分為兩種：一是植物本身特異性表達蛋白的基因的啟動子，如能在韌皮部特異表達的玉米蔗糖合成酶基因Sh1啟動子，谷氨酰胺合成酶基因GS34啟動子；二是能特異性侵染植物維管組織的病毒基因啟動子（劉昱輝和賈士榮，2003）。韌皮部特異性啟動子的研究韌皮部特異性啟動子區(qū)別于其它類型啟動子的一個顯著特點是在該類啟動子序列中存在一段與啟動子的韌皮部特異性表達有關(guān)的序列。將幾種韌皮部特異性啟動子的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)在距TATAbox上游的不同位置，有一個13bp的保守序列T/ATAAGT/AACGAAT/CC/A，它可能與韌皮部特異表達有關(guān)，除此保守序列外，啟動子中可能還存在其它的決定韌皮部特異性的元件，例如在對楊樹樹皮貯藏蛋白(barkstorageprotein,BSP)基因、筍瓜韌皮部蛋白2基因(PP2)及竹節(jié)花黃斑駁病毒(commelinayellowmottlevimsCoYMV)啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，前兩者分別存在特征序列GCTATG和CGTATG,推測(G/C)(G/C)TATG序列可能也與啟動子的韌皮部特異性及啟動子的活性密切相關(guān)(張海利和呂淑霞，2003)。蔣浩等將筍瓜韌皮部蛋白(phloemprotein)PP2楊樹樹皮儲藏蛋白BSP啟動子通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，首次用轉(zhuǎn)基因植物證明筍瓜PP2上一頁[3][4][5]基因啟動子可驅(qū)動外源基因在異源植物韌皮部及分生組織中特異性表達。種子和果實中特異性啟動子的研究李麗等利用PCR技術(shù)從油菜基因組DNA中分離napinB啟動子，該啟動子為種子特異表達。通過比較發(fā)現(xiàn)，不同napinB基因啟動子5’端起始密碼子前300bp中相當(dāng)一部分序列是保守的，越靠近起始密碼子，同源性越高，甚至某些區(qū)段核苷酸序列高度一致。由此可見，napinB基因啟動子間具普遍同源性。napinB啟動子5’上游區(qū)域與以往發(fā)表的napin啟動子編碼區(qū)比較表明，一些序列在進化上具有保守性，可能影響基因調(diào)控并與種子特異表達密切相關(guān)。2A12是番茄中另一種果實特異性啟動子。毛自朝等(2002)用PCR方法獲得了番茄果實