限制性內(nèi)切酶

基因組DNA目的基因基因載體重組體基因重組1分子克隆用工具酶EnzymesforMolecularCloning2核酸核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶磷酸酶3常用工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶45’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶核酸酶55’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸內(nèi)切酶6限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ7限制性酶概念命名作用●●●RESTRICTIONENZYMES

8EcoliK株噬菌體EcoliK株其他Ecoli菌株限制現(xiàn)象微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。9限制性內(nèi)切酶能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。認為細菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，10

細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷，保證其不為外來噬菌體所感染，而自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護。限制－修飾體系（Restriction/Modification）此酶在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA。此酶在序列5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’中的胞嘧啶C5上引入甲基.（1）dam甲基化酶（2）dcm甲基化酶甲基化酶

：在專一位點上甲基化，與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)11能識別限制酶識別的序列，并把其中的某些堿基甲基化（常見使限制酶識別序列中的C或A甲基化修飾），屬修飾酶類。經(jīng)修飾的DNA不再被限制酶降解。已分離到與許多Ⅱ類限制酶相對應(yīng)的甲基化酶。其命名是在對應(yīng)II類限制酶名稱前加一個M表示。如M．EcoRI是能使EcoRI識別序列中(GAATTC)3’-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶12一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)NNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’13第1個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，大寫；第2，3二個字母是該細菌的種名，小寫；第4個字母代表株；用大寫羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬種株序Haemophilusinfluenzaed株從流感嗜血桿菌d株中分離到的第3個限制酶前三個字母用斜體表示。以限制酶來源的微生物學(xué)名進行命名大腸桿菌（Escherichiacoli）R株中分離，EcoRI、EcoRII、EcoRV屬名+種名+株/型+發(fā)現(xiàn)序號14

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列155’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’16

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）171970年Smith等流感嗜血桿菌株中分離出HindII和HindIII已分離400余種II類酶商品化的約有一百種實驗室常用的二十種18I類識別位點，并切開之，但識別位點并非嚴(yán)格專一，ATP依賴II類識別位點嚴(yán)格專一，并在識別位點內(nèi)將單鏈切斷III類識別位點嚴(yán)格專一，但切點不專一，往往不在識別位點內(nèi)部，ATP依賴基因工程中具有實用價值的是II類限制性內(nèi)切酶★★★二、分類19緩沖系統(tǒng)pH7.5，Mg2+，鹽濃度（NaCl）高鹽：100-150mM中鹽：50-100mM低鹽：0-50mMII類酶的酶活條件：20BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口每一種限制酶能辨認特定的限制位點(restrictionsite)。多數(shù)限制酶不在兩股的同一位置（即限制位點中央）切割，產(chǎn)生兩個單股尾巴，稱粘性末端（cohesive/stickyend)，因為它容易與另一個DNA片段的互補黏端相結(jié)合。有些限制酶從限制位點的正中央切割，所產(chǎn)