基因工程疫苗研究進(jìn)展

基因工程疫苗研究進(jìn)展

2對(duì)小鼠的免疫作用隨著對(duì)互補(bǔ)反應(yīng)藥物的研究的發(fā)展，可作為生物器的生物免疫藥物的使用逐漸體現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景。國外在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的已有細(xì)菌疫苗、病毒疫苗等,如大腸桿菌熱敏腸毒素B亞單位(LT-B)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、諾沃克病毒外殼蛋白(NVCP)、口蹄疫病毒(FMDV)、狂犬病病毒糖蛋白、變異鏈球菌表面蛋白(SPaA)、霍亂毒素B亞單位(CTB)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、兔出血病病毒(RHDV)、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原等10多種疫苗,所涉及的宿主植物主要有馬鈴薯、煙草、萵苣、香蕉、番茄等(龐俊峰等,2011)。2.1大腸桿菌熱敏腸毒素B亞單位(LT-B)在諸多研究中,對(duì)LT-B轉(zhuǎn)基因植物的研究相對(duì)較多,效果也較好。1995年Haq等用LT-B編碼基因?qū)霟煵莺婉R鈴薯中,外源基因均能表達(dá),并有較好的免疫原性。利用煙草葉浸提物直接飼喂小鼠,免疫30~32d后,血清IgG和黏膜IgA抗體水平與同劑量細(xì)菌性LT-B灌服的免疫小鼠抗體水平完全一致。Karaman等(2006)將大腸桿菌熱敏腸毒素基因轉(zhuǎn)入玉米中,通過對(duì)基因的改造,使其表達(dá)一種無毒性的LT-B蛋白;用這種轉(zhuǎn)基因玉米飼喂幼年和成年小鼠后,小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了免疫反應(yīng)。Lauterslager(2001)等利用農(nóng)桿菌Ag10轉(zhuǎn)化馬鈴薯,約有一半轉(zhuǎn)基因植株中的LT-B表達(dá)量都較高。又有研究結(jié)果表明,人生食轉(zhuǎn)LT-B基因馬鈴薯,7d后,在血液和糞便中可部分檢測出IgA和IgG特異性抗體,并證明有中和活性,但不同個(gè)體食用轉(zhuǎn)基因LT-B疫苗后反應(yīng)均有不同。2.2乙型肝炎病毒表面抗原乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的以肝臟為主要損害器官的傳染病,也是世界上最常見的傳染病之一。近年來,編碼乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的基因成功導(dǎo)入了大豆懸浮細(xì)胞、羽扇豆、馬鈴薯及煙草等植物中(Lou等,2007)。第1次關(guān)于乙型肝炎病毒表面抗原的研究是Mason等在1992年采用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的方法在煙草中表達(dá)乙肝表面抗原HBsAg。Koprouski等(1995)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用rHBsAg基因轉(zhuǎn)化羽扇豆和萵苣,用獲得的轉(zhuǎn)基因植株飼喂小鼠,結(jié)果檢測到顯著的乙肝病毒特異抗體;人食用轉(zhuǎn)基因萵苣,也獲得了IgG抗體應(yīng)答。趙秀英等(2002)利用基因槍轉(zhuǎn)化胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,提取10株NJH-T5分化幼苗的蛋白質(zhì)經(jīng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測,其rHBsAg、preS2Ag均為陽性。為方便口服,人們逐漸嘗試?yán)闷胀ㄋ?、蔬菜等植物來表達(dá)抗原蛋白。婁曉鳴等(2005)將乙肝表面抗原蛋白基因在蘋果和番茄中轉(zhuǎn)化表達(dá),ELLSA檢測其蛋白在蘋果核和番茄中被正確表達(dá),通過電鏡對(duì)蘋果葉片及番茄果實(shí)提取物進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了HBsAg顆粒。2003年中國研究者成功地將HBsAg基因?qū)霗烟抑?并用櫻桃漿果組織飼喂小鼠,小鼠成功產(chǎn)生免疫抗原性,并與經(jīng)商業(yè)疫苗免疫的小鼠具有相似性(Gao等,2003)。但HBsAg在萵苣葉片、香蕉果肉中的表達(dá)量很低,目前還在初級(jí)試驗(yàn)階段,在可食用轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量最高的是在馬鈴薯中。2.3口蹄疫病毒口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種感染偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病(吳國華等,2008)?？谔阋呓Y(jié)構(gòu)蛋白VP1為主要抗原位點(diǎn),能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗FMDV中和抗體和抗病毒保護(hù)性免疫,是基因工程疫苗研究的主要對(duì)象。用此VP1蛋白基因轉(zhuǎn)化芥菜和苜蓿(Carrillo等,1998)可成功獲得轉(zhuǎn)基因植株,用含有重組口蹄疫VP1的葉片浸提物直接飼喂免疫小鼠,均可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體,這種抗體不僅能與VP1發(fā)生反應(yīng),而且也能與完整的口蹄疫病毒顆粒發(fā)生反應(yīng)(Wigdorovitz等,1999),所有的免疫小鼠都能抵抗口蹄疫病毒的攻擊。Dus等(2002)將口蹄疫VP1蛋白與GUS融合基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中表達(dá),表達(dá)量為可溶性蛋白總量的0.5%~1.0%,供試小鼠產(chǎn)生了相似的病毒特異性免疫反應(yīng)。宋東光等(2011)利用國內(nèi)自主克隆的馬鈴薯塊莖專一性表達(dá)classⅠpatatin的啟動(dòng)子與VP1基因融合,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)VP1的馬鈴薯植株,進(jìn)一步檢測其表達(dá)及免疫原性,為開發(fā)FMDV口服疫苗打下了基礎(chǔ)。2.4諾沃克病毒外殼蛋白(NVCP)諾沃克病毒是一種能夠引起人類劇烈胃腸炎的病毒。Mason等(1996)在研究轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)rHBsAg、rLT-B的基礎(chǔ)上,利用農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化馬鈴薯和煙草,在其中表達(dá)的rNVCP具有良好的免疫原性。用轉(zhuǎn)化后的煙草葉片與馬鈴薯塊莖分別飼喂小鼠,均能產(chǎn)生特異性抗體。Tacket等(2000)報(bào)道,20個(gè)志愿者食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后,有19人產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答,抗NVCP的IgG滴度比免疫前上升了12倍,IgM上升了7倍。2.5狂犬病病毒糖蛋白狂犬病是一種由狂犬病毒引起的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病,主要是通過感染動(dòng)物的唾液進(jìn)行傳播。McGarvey等(1995)和Sun等(2003)都將狂犬病病毒G蛋白基因轉(zhuǎn)入過番茄,獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株中表達(dá)的重組蛋白能與多克隆抗體形成免疫沉淀,表達(dá)產(chǎn)物均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,但G蛋白的表達(dá)量很低,每克可溶性蛋白中只含1~10ngG蛋白。番茄表達(dá)的糖蛋白已具有天然糖蛋白的主要抗原決定簇,能與天然糖蛋白誘導(dǎo)的多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。用含有狂犬病病毒的重組植物病毒免疫小鼠,小鼠產(chǎn)生了中和性抗體,用被重組病毒感染的菠菜葉飼喂小鼠,均能產(chǎn)生免疫應(yīng)答,40%的小鼠能夠抵抗高劑量狂犬病病毒的攻擊(Modehka等,1998)。3基因疫苗的免疫抑制效果3.1免疫原性和免疫保護(hù)效果問題轉(zhuǎn)基因植物疫苗能否產(chǎn)生免疫原性,是研究植物基因工程疫苗的根本。植物基因工程疫苗的研究雖已取得較大進(jìn)展,但仍存在諸多問題,如免疫原性低,抗原在消化道內(nèi)易被不同程度降解,從而影響免疫保護(hù)率等問題。有2個(gè)因素要予以考慮和研究:①基因工程疫苗的分子質(zhì)量很小,作為抗原其免疫原性會(huì)減弱;②植物本身可能含有一些因素會(huì)影響或干擾重組蛋白產(chǎn)生免疫原性,這需要進(jìn)一步的研究證明。要提高免疫原性,防止抗原在口服時(shí)被消化降解,可在抗原基因附近加上一些修飾基因或吸附基因序列(曲靜等,2010),或?qū)⒖乖M裝成病毒顆粒樣的有序結(jié)構(gòu),以增強(qiáng)其免疫原性,保護(hù)口服疫苗不被迅速消化,長時(shí)間停留在消化系統(tǒng)內(nèi)。Modelsk等(2003)試驗(yàn)證明機(jī)體食用植物組織比食用植物組織提取物產(chǎn)生的保護(hù)性免疫反應(yīng)更強(qiáng),這是因?yàn)榭乖谥参镏斜粓?jiān)實(shí)的細(xì)胞壁或膜腔包裹,在胃中不易被胃液消化降解,大大提高了轉(zhuǎn)基因植物抗原的免疫原性。一些志愿者口服轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原基因的馬鈴薯,絕大部分志愿者血液中的抗乙型肝炎表面抗原的抗體明顯增強(qiáng),且沒有產(chǎn)生任何不良的副作用(Thanavala等,2005)。這2個(gè)試驗(yàn)說明在消化道中植物細(xì)胞壁對(duì)抗原確實(shí)具有保護(hù)作用,在經(jīng)過消化道的過程中,使植物細(xì)胞內(nèi)的疫苗免受酸性環(huán)境的影響和各種消化酶類的降解。經(jīng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)疫苗與基因工程疫苗聯(lián)合使用時(shí)可加強(qiáng)免疫效果。Webster等(2002)通過試驗(yàn)證明,小鼠經(jīng)單劑量的麻疹病毒血凝素DNA疫苗免疫后,再口服血凝素植物轉(zhuǎn)基因疫苗提取物,特異性IgG滴度可以提高10倍。Wu等(2004)研究也發(fā)現(xiàn),雞傳染性法氏囊病在傳統(tǒng)疫苗免疫下,只能使雞產(chǎn)生78%的保護(hù)力,而在傳統(tǒng)疫苗免疫1周后口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗,可使雞產(chǎn)生90%的保護(hù)力。Richter等(2001)研究結(jié)果表明,用商業(yè)來源的乙肝疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行初免疫后,再用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)的乙肝疫苗再次免疫,結(jié)果顯示免疫應(yīng)答得到高度加強(qiáng)。Thanavala等(2005)對(duì)注射過乙肝亞單位疫苗的志愿者的HBsAg免疫原性進(jìn)行觀察,然后生食2次和3次轉(zhuǎn)基因馬鈴薯(每次100g),再次觀察表達(dá)的HBsAg免疫原性,分別有52.9%和62.5%的志愿者血清抗體有33倍和56倍的增長。由此可見,基因工程疫苗為提高其他類型疫苗的保護(hù)效果提供了一種新的途徑。3.2外源蛋白在植物中的表達(dá)量問題轉(zhuǎn)基因植物疫苗抗原表達(dá)量低也是限制其發(fā)展的主要因素之一,其表達(dá)水平很大程度上取決于表達(dá)的蛋白質(zhì)和用于表達(dá)植物的種類,構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)也影響抗原的表達(dá)水平。雖然抗體的表達(dá)量可以達(dá)到總可溶性蛋白的8%,但是其他蛋白質(zhì)的表達(dá)水平幾乎沒有超過0.40%的(Ma等,2005)。目前已研究出提高抗原表達(dá)量的方法有許多種,包括定位表達(dá)、通過融合蛋白表達(dá)抗原蛋白、加上強(qiáng)啟動(dòng)子、優(yōu)化外源基因密碼子、多種疫苗聯(lián)用等。隨著植物基因工程疫苗研究的深入,體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)和毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)可能會(huì)成為提高抗原蛋白基因在植物體內(nèi)表達(dá)的另一種方法。3.3生物安全問題轉(zhuǎn)基因植物疫苗的安全性問題包括環(huán)境安全性問題和食用安全性問題。環(huán)境安全性問題主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物可以通過花粉傳播造成基因漂移,影響環(huán)境生態(tài)平衡,對(duì)環(huán)境中許多有益生物產(chǎn)生直接或間接的不利影響。此外,轉(zhuǎn)基因植物還可能將一些抗病或?qū)Νh(huán)境脅迫具有耐性的基因轉(zhuǎn)移給雜草,嚴(yán)重威脅其他作物的正常生長和生存(朱峰偉等,2010)。另外,由于絕大部分轉(zhuǎn)基因植物的篩選都是通過抗生素基因進(jìn)行的,長期使用使微生物產(chǎn)生抗性,不僅會(huì)造成環(huán)境安全性問題,還可能造成食用安全性問題。目前,有學(xué)者提出要改進(jìn)轉(zhuǎn)化技術(shù),避免使用含抗生素抗性基因的載體,由此減輕進(jìn)而消除此方面的危害(程志強(qiáng)等,2002)。人或動(dòng)物口服轉(zhuǎn)基因植物后還可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生某些毒理作用或引起過敏反應(yīng),這些不良反應(yīng)在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前必須進(jìn)行充分的試驗(yàn)論證,確保使用轉(zhuǎn)基因植物疫苗的安全性(Carter等,2002)。除安全問題以外,現(xiàn)有研究還存在一些其他困難。如人類對(duì)各類植物的基因構(gòu)成不夠了解,轉(zhuǎn)基因植物僅限于模式植物(如煙草、馬鈴薯等),這些植物由于各種原因不能直接食用,必須對(duì)其表達(dá)的疫苗進(jìn)行分離純化,從中提取抗原,后期費(fèi)用較大,這樣基因工程疫苗就失去了與傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)相比在價(jià)格上的優(yōu)勢(王軍政等,2011)。因此,要不斷開發(fā)蔬菜、水果等可直接食用的宿主植物?，F(xiàn)階段的研究水平較低,使在目標(biāo)宿主植物的選擇上受到局限,而如何調(diào)控水果內(nèi)疫苗物質(zhì)的生成量,如何標(biāo)注有效劑量,可食部位抗原的穩(wěn)定性,以及服用時(shí)間的差異問題也需深入研究。由于轉(zhuǎn)基因沉默或外源基因丟失等原因,常使外源基因在植物中表達(dá)不穩(wěn)定,轉(zhuǎn)基因植物疫苗所需的使用劑量就很難確定,限制了植物基因工程疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)(朱宏等,2009)。雖然,能穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物可以通過篩選后代得到,但是篩選過程復(fù)雜、耗時(shí)。因此,研究出更為有效的方法來解決轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)不穩(wěn)定性的問題是下一個(gè)研究重點(diǎn)。除此之外,口服免疫產(chǎn)生的免疫耐受、免疫記憶等需進(jìn)一步研究。免疫耐受的程度與免疫劑量﹑免疫程序﹑抗原特異性等多種因素有關(guān)。研究結(jié)果證明,減少疫苗服用次數(shù),加大每次攝入量等方法可以減少免疫耐受的發(fā)生。Antzen等認(rèn)為,飼用植物疫苗抗原只要是模仿病原因子(病毒樣顆?；蚨舅氐?,就不會(huì)引起免疫耐受,但同時(shí)也承認(rèn),對(duì)此還要仔細(xì)研究(任雪艷等,2004)。4轉(zhuǎn)基因植物疫苗目前,植物基因工程疫苗的研制尚處于初級(jí)階段,還未培育出成熟的植物轉(zhuǎn)基因疫苗品種,但相關(guān)研究已取得較大進(jìn)展。植物系統(tǒng)生產(chǎn)的抗原疫苗可保持天然免疫原的形式,使大規(guī)模生產(chǎn)抗原疫苗成為可能,利用植物基因工程疫苗技術(shù)生產(chǎn)畜禽疫苗也更具有現(xiàn)實(shí)意義和發(fā)展?jié)摿?。植物可食疫苗既可以提高其他類型疫苗的免疫效?同時(shí)也可以避免其他類型免疫多次接種的繁瑣操作,應(yīng)用前景廣闊,因此對(duì)可食疫苗機(jī)理的研究,如確定食用疫苗的安全性、有效劑量及抗原含量的穩(wěn)定性是重要的研究課題。研制疫苗的根本目的就是要獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益,將不同抗原基因的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行雜交,容易獲得多價(jià)轉(zhuǎn)基因植物疫苗,能降低生產(chǎn)成本、簡化免疫程序,且可以克服不同病毒弱毒苗間產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象,因此這將是基因工程疫苗研究的主要方向。該領(lǐng)域的研究將促進(jìn)相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí),從而推動(dòng)整個(gè)疫苗研制的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗利用分子生物學(xué)技術(shù),將病原微生物的抗原編碼基因?qū)胫参?并在植物中表達(dá)出活性蛋白,人或動(dòng)物食用含有該種抗原的轉(zhuǎn)基因植物,會(huì)激發(fā)腸道免疫系統(tǒng),從而產(chǎn)生對(duì)病毒、寄生蟲等病原菌的免疫能力(Mason等,2002)。它沒有病原菌完整的侵染能力,卻可以使機(jī)體對(duì)特異病毒或細(xì)菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),簡單來說,轉(zhuǎn)基因植物疫苗是利用植物系統(tǒng)表達(dá)病原菌抗原蛋白1個(gè)或幾個(gè)亞單位的疫苗。Tacket等(1998)首次報(bào)道了在煙草中表達(dá)鏈球菌(Streptococcus)抗原蛋白SpaA,Mason等在1992年提出了利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗,1997年,轉(zhuǎn)基因可食植物疫苗的第1次臨床試驗(yàn)證明了植物基因工程疫苗在抵抗傳染病方面的巨大潛能。利用植物作為抗原表達(dá)和遞送的載體已經(jīng)成為當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一,轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗的應(yīng)用前景廣闊,受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。1真核實(shí)驗(yàn)疫苗傳統(tǒng)疫苗在預(yù)防疾病的傳播過程中發(fā)揮了重要作用,但也存在著許多不盡人意的地方,如生產(chǎn)成本較高、接種方式復(fù)雜及潛在安全性等問題?，F(xiàn)今,疫苗的類型由菌體疫苗發(fā)展到亞單位疫苗、DNA疫苗等,但這些疫苗價(jià)格昂貴,不易大面積推廣使用。轉(zhuǎn)基因植物疫苗的載體為高等綠色植物,是一種較為完善的真核表達(dá)系統(tǒng),與生產(chǎn)傳統(tǒng)亞單位疫苗的大腸桿菌和酵母大有不同。這種疫苗以植物作為生物反應(yīng)器(龐俊峰等,2011),環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng),培養(yǎng)的條件更為寬松,前期不需要專用的設(shè)備和培養(yǎng)基,后期