內(nèi)毒素血癥對非酒精性脂肪性肝炎的影響

內(nèi)毒素血癥對非酒精性脂肪性肝炎的影響

近年來，肝臟疾病與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系日益受到關(guān)注。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明各種肝臟損傷均可發(fā)生內(nèi)毒素血癥,其中非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholsteatohepatitis,NASH)在世界范圍廣泛分布,其發(fā)病率逐年上升。NASH也是部分患者隱源性肝硬化的重要原因。本研究觀察了NASH模型8周、12周大鼠門靜脈和腹主動(dòng)脈血內(nèi)毒素(endotoxin,ET)水平的變化及其肝臟的病理學(xué)改變,旨在闡明腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinalendotoxemia,IETM)在NASH發(fā)病中起著重要的作用。1材料和方法1.1試劑盒和cd14健康Wistar雄性大鼠36只,體質(zhì)量180～220g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,膽固醇購于南京建成生物工程研究所,豬油自備。鱟試劑盒購自上海伊華臨床科技公司;CD14一抗、二抗均購于武漢博士德生物有限公司;紅外線同位素能譜分析儀(IRIS)由德國瓦格納公司生產(chǎn)。1.2大、小鼠血樣功能檢測①動(dòng)物模型的制作參考鐘嵐脂肪性肝炎模型的建立,常規(guī)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為3組:對照組、模型組、治療組(高脂飲食+5%甘氨酸)各組12只,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水。②13C-美沙西丁呼氣試驗(yàn)檢測肝細(xì)胞功能。③動(dòng)物處理于實(shí)驗(yàn)第8周、12周末,禁食過夜,次日稱量體質(zhì)量后以1.0%戊巴比妥鈉(3.0ml/100g體質(zhì)量,皮下注射)麻醉,手術(shù)開腹,在無菌無熱原條件下,分別從門靜脈、腹主動(dòng)脈采血2.0ml,離心4000轉(zhuǎn)/min,15min,吸取上清液置-70℃保存,待測ET水平,所有血標(biāo)本接觸的器具均要求保證無污染;取肝右葉中部一塊組織用10%甲醛固定、石蠟包埋、切片,做HE染色組織學(xué)觀察以及免疫組化法檢測CD14。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉxˉ±s)表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)行單因素方差分析,兩組間比較用SNK(q檢驗(yàn))以及配對t檢驗(yàn),以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組大鼠門靜脈et水平比較ET水平檢測結(jié)果8周、12周模型組大鼠門靜脈ET水平與對照組比較均明顯升高,治療組大鼠門靜脈ET水平有所降低,腹主動(dòng)脈血ET與相對應(yīng)門靜脈ET比較有顯著性差異(t值分別為-7.49、12.05、-6.68和-6.07,P<0.01);腹主動(dòng)脈各組間ET比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。2.21治療組與對照組治療前后比較好,達(dá)峰時(shí)間后移、豐度相對提高12周模型組大鼠的呼氣峰值(DOB)與對照組比較有顯著性差異,而且達(dá)峰時(shí)間較對照組前移,豐度明顯增高,治療組的DOB值降低,達(dá)峰時(shí)間后移,豐度降低;累積呼氣量(CUM60min)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,8周實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。2.3肝組織he染色光鏡下,對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清楚,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列成肝索狀,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,細(xì)胞呈多邊形;而高脂飲食8周,大鼠肝組織HE染色顯示即有局灶性肝細(xì)胞脂肪變性,呈以小泡性為主的混合性脂肪變性,局部出現(xiàn)小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤;隨著時(shí)間的延長,造模12周大鼠呈中-重度脂肪肝,部分脂滴形成大空泡,將細(xì)胞核擠壓至一邊,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞排列不規(guī)整,并伴大量肝細(xì)胞腫脹,部分呈氣球樣變,所有大鼠均可見到小葉內(nèi)炎癥,炎癥細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞為主,伴點(diǎn)狀或小灶性壞死,治療組上述病變減輕。2.4肝組織cd14陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果CD14表達(dá)對照組大鼠肝組織僅有少量細(xì)胞表達(dá)CD14抗原(10.30±2.20)個(gè)/高倍視野,主要位于肝竇內(nèi);造模8周模型組大鼠肝組織CD14陽性細(xì)胞數(shù)量已明顯增多(20.00±3.00)個(gè)/高倍視野與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,12周陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(56.20±13.60)個(gè)/高倍視野與對照組比較有顯著性差異P<0.01,陽性細(xì)胞主要也位于肝竇內(nèi),部分則呈灶型聚集;治療組CD14陽性細(xì)胞數(shù)量(17.64±5.40、48.18±6.51)個(gè)/高倍視野。3cd14與肝臟組織病理學(xué)的關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NASH動(dòng)物模型第8周、12周門靜脈ET水平明顯升高,提示NASH伴有腸源性內(nèi)毒素血癥的形成,而腹主動(dòng)脈血中ET水平與正常對照組無差異,可能是此時(shí)枯否細(xì)胞仍有一定的能力清除ET。該結(jié)果與范建高等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。CD14是脂多糖(LPS)或LPS-脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的受體以糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白形式存在于單核巨噬細(xì)胞表面,其在介導(dǎo)ET引起的細(xì)胞活化過程中起啟動(dòng)作用。研究發(fā)現(xiàn)在8周、12周CD14表達(dá)逐漸增高,與肝組織病理學(xué)改變一致,其機(jī)制可能是LPS或LPS-LBP與CD14結(jié)合不斷刺激肝臟枯否細(xì)胞產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞因子,這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生放大效應(yīng)反過來加重肝臟損害。陳寶昌等研究顯示,隨著NASH患者病情加重,其血清ET水平和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量均相應(yīng)升高,血清TNF-α含量與NASH患者肝損傷程度相一致。13C-美沙西丁呼氣試驗(yàn)原理為其標(biāo)記在肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450多種酶上,發(fā)生0-位脫甲基,生成對乙酰氨基酚和甲醛,后者繼續(xù)氧化生成CO2,用排出速度及豐度反映肝細(xì)胞的實(shí)時(shí)功能。本研究中,12周模型組大鼠的DOB值和CUM60min值均高于正常對照組,并且達(dá)峰時(shí)間也前移,豐度明顯增高,可能提示NASH時(shí),肝臟發(fā)生中重度病變,肝細(xì)胞微粒體功能發(fā)生紊亂即細(xì)胞色素P450多種酶活性增高,使13C-美沙西丁脫甲基后氧化生成大量CO2。肝臟組織切片HE染色觀察,肝組織病變程度與13C-美沙西丁呼氣試驗(yàn)結(jié)果基本相符。Portincasa等通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),與正常人群和單純脂肪肝病人相比較,N