銀杏內(nèi)生真菌多樣性及演替分析

銀杏內(nèi)生真菌多樣性及演替分析

1866年，deja指出植物中存在內(nèi)生微生物。特別是在20世紀(jì)80年代之后，大量植物內(nèi)生植物的資源得以挖掘，這證實(shí)內(nèi)生植物在植物體內(nèi)是普遍存在的（郭良東，2001）。從不同植物中分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量不同,Fisheretal(1993)從光葉大戟EucalyptusnitensMaiden上分離到60多種內(nèi)生真菌。但是僅憑種數(shù)多寡來評價(jià)某種植物的內(nèi)生真菌多樣性豐富與否雖然直觀卻不夠科學(xué)、客觀和準(zhǔn)確。另一方面,已有的研究資料表明:由于協(xié)同進(jìn)化的作用使得某些內(nèi)生真菌具有宿主專一性,平均每種植物有4-5種專性內(nèi)生真菌(Petrini1991),因此,選擇特有植物根據(jù)分離率分析內(nèi)生真菌的特定組成和演替變化、運(yùn)用多樣性指數(shù)來評價(jià)其內(nèi)生真菌的豐富度將有助于植物內(nèi)生真菌多樣性研究的深入。銀杏GinkgobilobaL.是單科單屬單種的多年生落葉喬木,為我國特有樹種。其內(nèi)生真菌的研究主要是由國內(nèi)一些研究者開展,且主要集中在生物活性菌株的研究上,如對與宿主銀杏相似的黃酮類化合物產(chǎn)生菌的分離和鑒定(王梅霞等2004;韓曉麗等2008),對產(chǎn)香的銀杏內(nèi)生鐮刀菌G1024菌株的生物學(xué)特性和揮發(fā)性成分的研究(蔣繼宏等2004;鞠秀云等2006),對銀杏內(nèi)生真菌抑菌活性的研究(申屠旭萍等2006,2007)等。在銀杏內(nèi)生真菌的多樣性研究上,周松林等(2006)采用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)分析了銀杏內(nèi)生刺盤孢的遺傳多樣性,甘金蓮等(2007)探討了銀杏內(nèi)生真菌生態(tài)分布的一些特征,樊有賦等(2007)則研究了銀杏內(nèi)生真菌的種群多樣性。本研究在江蘇和山東兩省的主要銀杏栽培基地分別于春、夏、秋三季定點(diǎn)隨機(jī)采樣,通過菌種分離和鑒定以及分離率和多樣性指數(shù)計(jì)算,分析了銀杏葉部組織中內(nèi)生真菌的組成、多樣性和分布特征。1材料和方法1.1采樣地和采樣方式分別于2007年春季(5月)、夏季(8月)及秋季(11月)在5個(gè)樣點(diǎn)(表1)采集銀杏葉樣品。在每一采樣地點(diǎn),隨機(jī)選取相隔一定距離的若干健康的銀杏植株采樣。樣品標(biāo)記后置于保鮮袋中,于4℃保存,在12h之內(nèi)對樣品進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。1.2馬鈴薯、葡萄糖、水馬鈴薯、菌株馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL,pH值自然,臨用時(shí)加250mg/L鏈霉素。1.3組織小段采用常規(guī)的真菌組織分離法(方中達(dá)1998)。葉片剪成0.5cm×0.5cm左右的組織小塊,葉柄剪成1cm長的小段。每次分離均選取葉片組織塊200個(gè),葉柄組織塊50個(gè)。1.4形態(tài)鑒定依照真菌的經(jīng)典分類鑒定方法,從純化后培養(yǎng)數(shù)日的菌落上挑取菌體制成切片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、有性或無性孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等的形態(tài)特征,鑒定到屬。真菌分類鑒定的工具書主要為《真菌鑒定手冊》(魏景超1979),半知菌的鑒定則主要依據(jù)Barnett&Hunter(1998)的系統(tǒng),并根據(jù)Kirketal.(2001)追尋屬的變動采用目前的屬名和定義。1.5內(nèi)生真菌群落生物多樣性的分析方法采用分離頻率比較判斷優(yōu)勢菌群。分離頻率(isolationfrequency,IF):分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離總的內(nèi)生真菌菌株數(shù)的百分率。采用分離率衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個(gè)組織塊受多重侵染的發(fā)生頻率。分離率(isolationrate,IR):分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離樣品組織塊總數(shù)的百分率。采用Shannon-Wiener指數(shù)(H)和Simpson指數(shù)(D)分析內(nèi)生真菌的群落生物多樣性。H=-Σ(Pi)(lnPi)、D=1-Σ(Pi)2,式中:Pi為屬于種i的個(gè)體在全部個(gè)體中的比例;采用Evenness指數(shù)(J)分析群落物種分布的均勻程度。J=H/lnS,式中:H為Shannon-Wiener指數(shù)、S為物種總數(shù)目;采用Sorenson(Cs)及Jaccard(CJ)相似性系數(shù)比較兩地之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。CS=2j/(a+b),CJ=j/(a+b-j),式中:j為兩個(gè)樣地共有種數(shù)或?qū)贁?shù);a和b分別為樣地A和樣地B的物種數(shù)或?qū)贁?shù)。2結(jié)果分析2.1內(nèi)生真菌的分類從五個(gè)地點(diǎn)三個(gè)季節(jié)采集的銀杏葉中共分離得到內(nèi)生真菌1971株,鑒定后歸于32屬,少數(shù)因不產(chǎn)孢而未鑒定出種屬的暫歸為一類——無孢菌群(Sterilemycelia)。分離得到的內(nèi)生真菌多屬于半知菌(94.82%),少數(shù)屬于子囊菌(2.38%)。在目的分類水平上以半知菌中的叢梗孢目Moniliales和球殼孢目Sphaeropsidales為優(yōu)勢菌群,分別占總菌株數(shù)的37.85%和31%;在科的分類水平上以球殼孢科、暗梗孢科、黑盤孢科為優(yōu)勢菌群,分別占總菌株數(shù)的30.84%、27.84%和10.75%;在屬的水平上以交鏈孢屬Alternaria、葉點(diǎn)霉屬Phyllosticta、絲核菌屬Rhizoctonia為優(yōu)勢類群,分別占總菌株數(shù)的18.01%、14.66%和14.56%(表2)。2.2生津和細(xì)菌之間的差異分布2.2.1內(nèi)部真菌在不同部位的分布2.2.2盤長孢屬genusspis,擬莖點(diǎn)霉屬u2004在5個(gè)采樣調(diào)查地區(qū)之間,銀杏葉中內(nèi)生真菌的菌群組成存在差異,在分離率上表現(xiàn)為南京>啟東>邳州>郯城>泰興的規(guī)律(圖1)。除共有的優(yōu)勢菌群以外,銀杏葉部內(nèi)生真菌還具有其各自地區(qū)的優(yōu)勢菌群。其中,南京為盤長孢屬Gloeosporium(3.55%),泰興為匐柄霉屬Stemphylium(1.07%),啟東為刺盤孢屬Colletotrichum(3.65%),邳州為閉果霉屬Sclerotiopsis(1.17%),郯城為擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis(3.75%)。此外,部分內(nèi)生真菌也具有一定的地理分布特性,泰興為擬青霉屬Paecilomyces(0.05%)和單格孢屬Ulocladium(0.10%),郯城為絲葚霉屬Papulospora(0.15%),邳州為黑腐菌屬Guignardia(0.15%),南京為小叢殼屬Glomerella(0.10%)(表3)。2.2.3菌株數(shù)量和種類在春、夏、秋三個(gè)季節(jié)中,春季內(nèi)生真菌的分離率為7.76%,顯著低于夏季的19.76%和秋季的25.04%(圖1)。在菌株數(shù)量和種類上,春季僅為291株和16種,都明顯低于夏季和秋季。夏季和秋季相比較,兩者在種群類別上差異不大,分別為28種和31種,只是秋季菌株數(shù)量939株略高于夏季的741株。2.3內(nèi)部空氣的多樣性2.3.1物種多樣性指數(shù)秋季在郯城所分離獲得的內(nèi)生真菌菌群的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最高(2.7102),夏季在啟東獲得的內(nèi)生真菌菌群的Shannon-Wiener指數(shù)最低(1.3902)。Simpson多樣性指數(shù)的范圍在0到1之間,結(jié)果與Shannon-Wiener指數(shù)是一致的,仍然是秋季郯城的最高及夏季啟東的最低,其指數(shù)分別為0.9041和0.6992(表4)。均勻度可以反映出群落中不同物種分布的均勻程度。通過對各內(nèi)生真菌種群均勻度指數(shù)的計(jì)算發(fā)現(xiàn),分離得到的內(nèi)生真菌種群均勻度各不相同,均勻度指數(shù)都在0.6以上。其中以春季泰興菌群的均勻度指數(shù)最高(0.9238),而夏季啟東菌群的最低(0.6327)(表4)。2.3.2內(nèi)生真菌菌群的相似性通過兩種相似性系數(shù)Jaccard指數(shù)和Sorenson指數(shù)的計(jì)算結(jié)果的比較,發(fā)現(xiàn)從5個(gè)采集地點(diǎn)分離獲得的內(nèi)生真菌菌群的相似性系數(shù)均大于0.5(表5),這說明各地銀杏內(nèi)生真菌菌群之間具有一定的相似性。其中南京與郯城、泰興與啟東之間的內(nèi)生真菌菌群有較高的相似性,它們之間的Jaccard指數(shù)和Sorenson指數(shù)分別為0.7586、0.7727和0.8627、0.8718(表5)。3研究發(fā)現(xiàn)與分析本研究所獲得的銀杏葉部組織的內(nèi)生真菌類群普遍被認(rèn)為腐生性較強(qiáng),所采集的樣本全部來自健康植株,宿主完全沒有受到傷害或感染病害的癥狀,應(yīng)該不會給腐生性真菌提供生長基質(zhì)。葉部組織材料的表面消毒徹底,可以排除葉表的腐生菌和附生菌,因此,可以認(rèn)為這些真菌是內(nèi)生的或至少是部分內(nèi)生且不引起植物病害,它們符合植物內(nèi)生真菌的有關(guān)定義(Petrini1991;Stoneetal.2000)。但是,本研究獲得的銀杏內(nèi)生真菌,除了閉果霉屬Sclerotiopsis、射盾孢屬Actinopelte和小叢殼屬Glomerella等個(gè)別類群尚未在銀杏以外的其它植物中見到報(bào)道外,其余大都已作為內(nèi)生真菌被廣泛分離報(bào)道,這可能與研究所采用分離培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基有關(guān)。考慮到不同的植物應(yīng)有特定的專一性內(nèi)生真菌物種,在今后的內(nèi)生真菌資源研究中,多種選擇性分離培養(yǎng)基的采用和將內(nèi)生真菌鑒定到種的水平是必要的。研究表明銀杏葉部組織內(nèi)生真菌在葉片和葉柄兩個(gè)部位的分布以及季節(jié)間存在差異。這可能是因?yàn)榇杭俱y杏葉柄部位發(fā)育較之葉片成熟,而到了夏季和秋季,隨著葉片發(fā)育完全,表面積的逐漸增大,原有內(nèi)生真菌從葉柄向葉片擴(kuò)展、或是外部真菌增加了侵染機(jī)會所致。另一方面,銀杏葉部組織中內(nèi)生真菌的類群與分布在不同地理生境下也存在著差異,這說明內(nèi)生真菌的類群和分布可能受到地理位置及其氣候環(huán)境等因素的影響。研究結(jié)果表明,不同地區(qū)銀杏葉部組織的內(nèi)生真菌在春季的種群數(shù)量及分離率都是最少和最低的,而在夏季和秋季均有很明顯的升高,這可能是與氣候、環(huán)境、降雨量等外在條件的季節(jié)性變化有關(guān),這與其他植物內(nèi)生真菌研究的結(jié)果相一致(Larranetal.2001;Vujanovic&Brisson2002;Santamar?′a&Bayman2005;柯海麗等2007)。不過,決定植物內(nèi)生真菌菌群分布、組成特征和演替變化的因素和作用機(jī)制既是多方面的又可能是較為復(fù)雜的,需深入研究。豐富度和均勻度指數(shù)是反映生境中真菌菌群分布的重要參數(shù),相似性系數(shù)是反映兩個(gè)不同生境中真菌菌群組成相似程度的重要參數(shù)。豐富度指數(shù)數(shù)值越大,表明種類越多,多樣性越高;均勻度指數(shù)則反映著種類之間個(gè)體分配的均勻性,其值越大,多樣性一般也越高;相似性系數(shù)越大,兩個(gè)生境的多樣性水平越接近。由本研究的多樣性指數(shù)及相似性系數(shù)的結(jié)果可以得出這樣的判斷,各采樣地點(diǎn)銀杏葉部組織中的內(nèi)生真菌菌群普遍具有較高的多樣性,因?yàn)榉謩e計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)獲得的多樣性參數(shù)所反映出來的結(jié)果是一致的,并不因春季分離獲得的菌群數(shù)量少些、夏季和秋季分離獲得的菌群多些而呈現(xiàn)出季節(jié)間的波動,均勻度指數(shù)也同時(shí)表明本研究各采樣地區(qū)內(nèi)銀杏葉部組織中的內(nèi)生真菌多樣性是比較穩(wěn)定的,組成菌群的分配是比較均勻的。本研究采樣地點(diǎn)中的江蘇泰興和山東郯城均被稱為我國的銀杏之鄉(xiāng),江蘇邳州又與山東郯城相鄰,銀杏植株生長緩慢而時(shí)間較長,因此也促成了銀杏內(nèi)生真菌多樣性的豐富和穩(wěn)定。相似性系數(shù)的結(jié)果更反映出銀杏葉部組織中的內(nèi)生真菌多樣性水平在