鄱陽湖老爺廟水域細菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系

鄱陽湖老爺廟水域細菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系

在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，細菌在有機物質(zhì)的分解、有機養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和土地化循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。因此對細菌的種群和多樣性的研究有利于全面了解湖泊生態(tài)系統(tǒng)的功能和微食物網(wǎng)中各營養(yǎng)級的相互作用。鄱陽湖是我國第一大淡水湖,是典型的過水性吞吐型湖泊,自2000年以來水質(zhì)維持在Ⅱ、Ⅲ類水平并正向富營養(yǎng)化過渡。鄱陽湖因其優(yōu)越的地理位置和豐富的物種資源而日益受到人們的廣泛重視,對鄱陽湖的研究熱烈,但主要集中在水質(zhì)參數(shù)的變化、動植物分布、鳥類遷徙等方面,對鄱陽湖水體微生物多樣性及其功能研究較少。本研究采用構(gòu)建細菌16SrRNA基因文庫的方法對鄱陽湖老爺廟水域兩個季節(jié)的水體細菌的結(jié)構(gòu)和組成進行了初步探討,并試圖了解水體微生物與環(huán)境因子變化的相互關(guān)系,為進一步實現(xiàn)“鄱陽湖一湖清水”提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)信息。1材料和方法1.1水樣的采集和保存分別于2006年10月和2007年5月在鄱陽湖老爺廟(29°20′50.95″N,116°04′14.66″E)水域進行水樣采集。2006年水樣分別于樣地水面下0.5m和水底上0.5m處采集并混合(水深3m);2007年水樣分別在水面下0.5m,3m和水底上0.5m處采集并混合(水深6.5m)。樣品采用2L的有機玻璃采水器采集,同時記錄湖水溫度、pH、溶解氧等化學(xué)參數(shù)。所有水樣采集后迅速運回實驗室保存于4℃進一步實驗。老爺廟流域?qū)掗?為全湖最深水域,沙質(zhì)底,采沙嚴(yán)重,無水生維管植物。1.2srdna基因序列及擴增500mL水樣經(jīng)0.22μm(Millipore,USA)濾膜過濾,提取過濾物細菌總DNA。細菌16SrRNA基因的PCR擴增采用引物27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′)(上海生工)進行。純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa)上并轉(zhuǎn)化,建立細菌16SrRNA基因的克隆文庫。從每個文庫隨機挑選單克隆進行PCR擴增篩選,得到的陽性克隆抽提質(zhì)粒并分別加入1U的HaeIII和HinfI內(nèi)切酶進行限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)。將具有相同的RFLP類型的克隆進行16SrDNA雙向測序后,除去嵌合體,每個文庫中序列的遺傳相似性>97%被歸為同一類操作單元類型(OTUs)。將所有OUTs序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中BLAST,利用MEGA4.1軟件中的鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行序列系統(tǒng)發(fā)育分析。1.3物理參數(shù)的測量水溫,pH,溶氧等采用美國YSI公司的水質(zhì)分析儀測定;總氮,總磷,COD的測定分別根據(jù)《水和廢水的監(jiān)測方法》進行。1.4物種豐富度指數(shù)的計算公式細菌的多樣性以香農(nóng)指數(shù)(H′)和辛普森指數(shù)(1/D)表示。H′的計算方法為:H′=-∑i=1i=n∑i=1i=npilnpi式中:pi是第i種OUTs在整個OUTs總數(shù)中的比例;n為總克隆數(shù)量。D的計算公式為:D=∑i=1i=n∑i=1i=np2ii216SrRNA基因文庫的庫容計算公式為:C=1-n/N,N代表16SrDNA文庫總克隆數(shù),n代表在文庫中僅出現(xiàn)一次的OTUs的數(shù)量。物種豐富度指數(shù)(Chao1)的計算公式為:S=Sobs+(a2/2b)式中:Sobs為OUTs克隆總數(shù);a為文庫中只出現(xiàn)一次的OUTs克隆數(shù);b為出現(xiàn)兩次的OUTs。采用T檢驗考察鄱陽湖水參數(shù)的時空變化(P≤0.05為顯著差異)。1.5注冊登記號以記錄號所測的細菌16SrRNA基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得的序列號為:HM749978-HM750042。2結(jié)果2.1分配富營養(yǎng)化狀態(tài)鄱陽湖老爺廟水域的基本物理化學(xué)參數(shù)(表1)。結(jié)果表明:目前鄱陽湖老爺廟地區(qū)水質(zhì)處于中-富營養(yǎng)化狀態(tài),并具有富營養(yǎng)化的趨勢,COD極高甚至達到了極富營養(yǎng)化程度。水化學(xué)參數(shù)季節(jié)變化明顯,其中2007年5月水體的溫度、pH、總N和總P明顯高于2006年10月水體,而2007年5月的溶氧明顯低于2006年10月(P<0.05)。2.2pn06-5重組病毒的克隆從兩個克隆文庫中各隨機挑選96個單克隆進行分析,結(jié)果見表2。表2顯示:PN06-10樣品92個陽性克隆中產(chǎn)生了34個不同的OTUs;PN07-5樣品88個陽性細菌克隆產(chǎn)生了32個不同的OTUs。構(gòu)建的文庫覆蓋率分別為75.8%和69.3%,表明所構(gòu)建的文庫涵蓋了樣地的大部分細菌種類;香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均表明該地域水體細菌多樣性信息比較豐富,且PN07-5中的細菌多樣性和豐富度低于PN06-10文庫。2.3水體變形菌群將所獲得的所有OTUs序列進行序列分類(/),得到細菌的主要組成如圖1。結(jié)果顯示:鄱陽湖老爺廟水域細菌主要由變形菌組成,其中PN06-10(2006年10月)水體中變形菌占總細菌數(shù)的85.7%;PN07-5(2007年5月)水體變形菌占總細菌數(shù)的51.6%。2006年10月水體優(yōu)勢菌群為Beta-變形菌(占總細菌數(shù)的63.7%);2007年5月水體優(yōu)勢菌群為Gamma-變形菌和擬桿菌(分別占總細菌數(shù)的25.3%)。結(jié)果提示:鄱陽湖老爺廟水域的細菌分屬于6大主要簇群(變形菌、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、浮霉菌(Planctomycetes)、酸桿菌(Acidobacteria)和OP10)。2.4物種及序列分析根據(jù)16SrRNA基因序列相似性比較并進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(圖2),結(jié)果顯示細菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化明顯。圖2結(jié)果表明:鄱陽湖老爺廟水域細菌的4種序列分屬于Alpha-的根瘤菌科(Rhizobiacea)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、拜葉林克氏菌科(Beijerinckiaceae);1種序列屬于Epsilon-變形菌中的弓形桿菌屬(Arcobacter);10種序列分屬于Gamma-中的不動桿菌科(Acinetobacter)、假單胞菌科(Pseudomonas)和未確定分類地位的Gamma-變形菌。圖3結(jié)果顯示:該地含有豐富的Beta-變形菌,且所屬類型較為廣泛,主要屬于:伯克氏菌目(Burkholderiales)、紅環(huán)菌目(Rhodocyclales),以及奈瑟菌目(Neisseriales),大部分序列與來自環(huán)境中的未培養(yǎng)細菌序列相似。其中屬于伯克氏菌目中的有:11種序列為叢毛單胞菌科(Comamonadaceae),3種序列屬于Incertaesedis5科,2種序列屬于伯克氏菌科(Burkholderiaceae),2種序列屬于草酸桿菌科(Oxalobacteraceae);2種序列屬于紅環(huán)菌目中的紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae),2種序列屬于奈瑟菌目中的奈瑟氏菌科(Neisseriaceae),以及未確定分類地位的Beta-變形菌。屬于叢毛單胞菌科的序列含量最多,占總Beta-變形菌的50.8%,主要分屬于食酸菌屬(Acidovorax),叢毛單胞菌屬(Curvibacter)和Polaromonas屬;屬于奈瑟氏菌科的序列其次,占總Beta-變形菌的15.9%,主要屬于Vogesella屬。圖4結(jié)果表明:鄱陽湖老爺廟水體7種細菌屬于放線菌中的放線菌目(Actinomycetales),占水體放線菌的76.5%,1種屬于未知分類地位放線菌(23.5%);7種序列屬于擬桿菌中鞘脂桿菌目中的屈桿菌科(Flexibacteraceae),黃桿菌目中的黃桿菌科(Flavobacteriaceae)以及Cryomorphaceae科,其中屬于黃桿菌目細菌占總擬桿菌的86.4%,鞘脂桿菌目占13.6%;1種序列屬于酸桿菌門中的酸桿菌科(Acidobacteriaceae);1種序列屬于OP10門中的OP10_genera_incertae_sedis科;2種序列屬于浮霉菌門中的浮霉菌屬。3老爺廟水體的細菌組成本研究采用構(gòu)建16SrRNA基因文庫后測序的方法對鄱陽湖老爺廟水域細菌的群落組成及季節(jié)變化進行了研究。結(jié)果表明鄱陽湖老爺廟水域細菌的多樣性和豐富度指數(shù)較高,但營養(yǎng)濃度高的2007年5月樣地細菌多樣性和豐富度均低于營養(yǎng)濃度低的2006年10月樣地。結(jié)果提示水體細菌的豐富度和多樣性與水體營養(yǎng)狀況密切相關(guān),該結(jié)果與馮勝等(2007年)的研究結(jié)果相似,即富營養(yǎng)湖區(qū)的細菌多樣性低于低營養(yǎng)湖區(qū)。鄱陽湖老爺廟水域細菌主要由變形菌,擬桿菌和放線菌等組成,屬于典型的淡水生態(tài)系統(tǒng)類群,其研究結(jié)果與2002年Sekiguchi等對鄱陽湖湖口研究結(jié)果相一致。但在不同的研究區(qū)域與不同的研究季節(jié),水體的優(yōu)勢菌群不同;菌群組成的比例不同,提示鄱陽湖水體細菌組成具有明顯的湖泊內(nèi)空間差異和季節(jié)變化。研究表明:在2007年5月老爺廟水域呈富營養(yǎng)化時,水體優(yōu)勢菌群為Gamma-變形菌和擬桿菌。Dai等對太湖水體細菌研究中發(fā)現(xiàn)Gamma-變形菌和擬桿菌是富營養(yǎng)化水生生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的菌群;奚萬艷等的研究也提示擬桿菌門可能與富營養(yǎng)化有著某種潛在關(guān)系。研究進一步發(fā)現(xiàn)Gamma-變形菌對水體的磷含量變化響應(yīng)迅速,隨著磷濃度的增加,Gamma-的數(shù)量明顯增加。結(jié)果進一步提示湖泊水體的營養(yǎng)狀況對優(yōu)勢菌群的組成影響巨大變化。值得注意的是,2007年5月水體的Alpha-變形菌是2006年10月的2倍,這可能與2007年5月水體pH為弱堿性,而2006年10月偏酸性有關(guān)。Lindstr?m&Leskinen的工作也證明:Alpha-變形菌喜歡pH中性或堿性的水環(huán)境,我們的結(jié)果支持pH的波動會通過生物機制直接影響微生物群落組成的觀念。由此我們推測pH和水體的營養(yǎng)狀態(tài)可能是決定鄱陽湖細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素?；?6SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析還發(fā)現(xiàn),鄱陽湖老爺廟水體中75%的細菌與和來自淡水、湖泊、污水處理廠、土壤中的未培養(yǎng)細菌相似。本研究還發(fā)現(xiàn),老爺廟水域的許多細菌具有降解和轉(zhuǎn)化環(huán)境污染物的能力,如Alpha-變形菌中的PN06-10-94(1個克隆子)與培養(yǎng)的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)同源性高達98%,后者能以多環(huán)芳烴作為唯一的碳源和能源而廣泛存在于各種被污染的環(huán)境中。屬于Beta-變形菌的PN06-10-11(5個克隆子)與野生稻上的固氮菌(Ideonellasp.)的同源性高達98%,PN06-10-59(1個克隆子)和PN06-10-85(2個克隆子)與紫色桿菌(Janthinobacteriumsp.)的同源性最高(99%),后者屬于腐敗菌種類。與Gamma-變形菌中的PN06-10-3(3個克隆子)和PN07-5-1(3個克隆子)親緣關(guān)系最近的可培養(yǎng)菌是Acinetobactersp.,同源性分別為97%和99%,后者屬于好氧異養(yǎng)硝化菌,能較好地降解環(huán)境中的氨氮,是常用的污水處理菌。結(jié)果提示鄱陽湖老爺廟水體細菌種類豐富,來源廣泛,可能與鄱陽湖連接長江及五大河流、每年水位變化明顯的水文特點有關(guān),更與湖泊周圍的農(nóng)業(yè)密集開發(fā)以及土壤浸蝕帶來了大量的異地細菌有關(guān)。4