實(shí)驗(yàn)六 紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的誘變效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)六紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的誘變效應(yīng)、抗菌素生物效價(jià)的評(píng)價(jià)及裂解性噬菌體效價(jià)測定（結(jié)果分析）?實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：?1、學(xué)習(xí)并掌握物理誘變——紫外射線誘變育種的方法。學(xué)習(xí)并掌握計(jì)算誘變后存活率及致死率的計(jì)算。學(xué)習(xí)透明圈和菌落直徑大小及HC比值計(jì)算。2、學(xué)會(huì)裂解性噬菌體效價(jià)測定方法。3、學(xué)會(huì)抗生素效價(jià)測定方法及利用檢定菌檢測微生物代謝產(chǎn)物的抗菌性。、紫外誘變枯草芽胞桿菌效應(yīng)1.紫外誘變過程：紫外線誘變采用15W紫外線殺菌燈；在正式照射前，應(yīng)先開紫外線lOmin,讓紫外燈預(yù)熱；燈與處理物的距離為30cm；無菌取菌懸液使其厚度為0.5?1.Ocm，放在紫外燈的照射臺(tái)上，開啟電磁攪拌器開關(guān)。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。照射時(shí)間：未照射前（0時(shí)），照射lmin,照射2min,照射3min時(shí)分別取樣0.5ml；每照射到時(shí)間馬上無菌取樣，加到已經(jīng)編號(hào)的第1個(gè)試管，為10-1，共有4個(gè)時(shí)間的10-1，分別將其稀釋至：0min1min2min3min稀釋度10-610-710-810-610-710-810-510-610-710-410-510-6每個(gè)稀釋度各取0.2ml涂平板，共涂12塊平板，做好標(biāo)記，37°C培養(yǎng)48hr。2.計(jì)算致死率?（1）對(duì)照樣品中活菌數(shù)：將培養(yǎng)至48h后對(duì)照古板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)平板上菌勤務(wù)員落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1ml菌液中的活菌數(shù)。同樣方法數(shù)出紫外線處理1、2、3min后的細(xì)菌數(shù)。（2）致死率計(jì)算：(%)=對(duì)照Inal菌液數(shù)-處理后lml菌液中活菌數(shù)

對(duì)照linl菌液中活菌數(shù)

(%)=?3.觀察誘變效應(yīng)?在平板菌落計(jì)數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。?分別測量透明圈菌落計(jì)算比值（HC值），與對(duì)照平板進(jìn)行比較。照射時(shí)間透明圈直徑菌落直徑照射時(shí)間透明圈直徑菌落直徑HC值未照射菌洛照射菌落1照射菌落2照射菌落3照射菌落4照射菌落5正向突變率（％）負(fù)向突變率（％）二、抗菌素濾紙片法測定生物效價(jià)?1.實(shí)驗(yàn)操作過程：（1）將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基滅菌融化，倒平板凝固后，用無菌吸管吸取培養(yǎng)好的試驗(yàn)菌液0.2m1,采用涂布法均勻涂于平皿表面。?（2）青霉素的稀釋：青霉素按10倍稀釋法稀釋至lU/m1。將直徑5mm的圓形濾紙片，分別蘸取1、10、100u/ml的青霉素溶液。在管壁貼至無液體流出時(shí)，放置在上述培養(yǎng)的表面上，輕壓固定，每個(gè)濃度貼在一個(gè)平板上。然后將培養(yǎng)皿放入37°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-18小時(shí)，測定抑菌圈的直徑。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果測定不同青霉素濾紙片周圍抑菌圈直徑青霉素劑量（U/ml）抑菌圈直徑（cm）110100三、噬菌體效價(jià)的測定1.實(shí)驗(yàn)操作過程：制備底層平板：平皿中先倒入肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。取0.5m1噬菌體濃縮液，加到4.5ml/管的1%蛋白胨水進(jìn)行10倍系列稀釋，依次稀釋至10-7稀釋度。?分別吸取最后三個(gè)稀釋度的噬菌體稀釋液0.1ml，和0.2ml敏感菌菌液直接加入到底層培養(yǎng)基上。立即將45-50C保溫的5ml上層半固體培養(yǎng)基倒入到底層培養(yǎng)基中混合均勻，使上層培養(yǎng)基均勻地鋪滿整個(gè)底層平板。2?噬菌體效價(jià)：是指1ml培養(yǎng)液中含侵染性的噬菌體粒子數(shù)。

1)噬菌斑計(jì)數(shù)：噬菌體稀釋倍數(shù)噬菌斑數(shù)噬菌斑數(shù)10-710-610-5對(duì)照2).噬菌體效價(jià)計(jì)算：以每皿出現(xiàn)30-300噬菌斑的平板計(jì)算噬菌體效價(jià)。侵染性噬菌體粒子數(shù)=每皿平均噬菌斑數(shù)侵染性噬菌體粒子數(shù)=每皿平均噬菌斑數(shù)X稀釋倍數(shù)0.lmZ本次實(shí)驗(yàn)總結(jié)：1.稀釋枯草芽胞桿菌誘變前：稀釋至10-8，生理鹽水枯草芽胞桿菌照射lmin取稀釋至10-8,生理鹽水枯草芽胞桿菌照射2min取稀釋至10-7,生理鹽水枯草芽胞桿菌照射3min取稀釋至10-6,生理鹽水青霉素稱取0.01克稀釋至1U/l，生理鹽水噬菌體噬菌體稀釋至10-9，蛋白胨水2.平皿(1)進(jìn)行枯草芽胞桿菌誘變3個(gè)時(shí)間和未誘變菌，取后三個(gè)稀釋度，共接12個(gè)平皿青霉素稀釋至1、10、100U/m1,加入到3個(gè)平皿中。噬菌體稀釋至10-9，取后三個(gè)稀釋度，每個(gè)二次重復(fù)，二個(gè)對(duì)照，共8個(gè)平皿。本次實(shí)驗(yàn)共接種23個(gè)平皿。實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：記錄紫外線誘變育種枯草芽胞桿菌及接種過程。記錄青霉素效