第三章 液相色譜

第三章液相色譜1第1頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本計(jì)算：tR’=tR－tM2第2頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜分離基本方程式R>1.53第3頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三章高效液相色譜法§3-3液相色譜法的主要類型及分離原理§3-6液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及基本概念§3-10毛細(xì)管電泳4第4頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）液相色譜儀（1）5第5頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜儀（2）6第6頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜儀（3）7第7頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)

（featureofHPLC）特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度。是高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。8第8頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月色譜法:

利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的微小差異,當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí),使被測(cè)物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配,使得原本小的差異產(chǎn)生大的效果,使物質(zhì)達(dá)到分離的一種方法.HPLC:

在經(jīng)典液體柱色譜的基礎(chǔ)上,在色譜理論指引下，采用高壓輸液設(shè)備、高效色譜柱和高靈敏度檢測(cè)器，并結(jié)合計(jì)算機(jī)數(shù)控技術(shù)，具有高度自動(dòng)化和智能化的一種液相色譜方法。9第9頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9

107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。液相色譜與氣相色譜的比較:（1）應(yīng)用范圍不同（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作（3）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。據(jù)統(tǒng)計(jì)大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析70~80%的有機(jī)物能用液相色譜分析10第10頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-2影響色譜分離的因素

（factorsinfluencedseparation）1.影響分離的因素與提高柱效的途徑

在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。11第11頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。2）由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。3）液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)，恒溫。4）改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。12第12頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-3

液相色譜主要類型與分離原理

◆分配色譜法

◆吸附色譜法

按原理分類

◆離子交換色譜法

◆排阻色譜法

◆親和色譜法13第13頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、液-液分配色譜

（liquid-liquidpartitionchromatography）固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；14第14頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

正相和反相鍵合色譜法

正相鍵合色譜法固定相極性大硅膠-OH(或雙-OH)，硅膠-CN

流動(dòng)相極性小烴類+適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN)分析對(duì)象多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物以及不同類型的化合物。反相鍵合色譜法固定相極性小如硅膠-C18，硅膠-苯基；流動(dòng)相極性大甲醇-水、乙腈-水、水和無機(jī)鹽的緩沖液。分析對(duì)象多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流動(dòng)相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如有機(jī)有機(jī)酸、有機(jī)堿和酚類。15第15頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、液-固吸附色譜

（liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。Flow流動(dòng)相活性吸附點(diǎn)固定相16第16頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、離子交換色譜

（ion-exchangechromatography）固定相：陰離子離子交換樹脂或陽(yáng)離子離子交換樹脂；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。17第17頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、離子對(duì)色譜

（ionpairchromatography）原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子

Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X-

后；在兩相間分配。18第18頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、離子色譜

（ionchromatography）

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。在離子色譜的基本結(jié)構(gòu)組成中，重要的和與其他高效液相色譜不同的就是抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器。19第19頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抑制器的作用廢液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity20第20頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、排阻色譜

（size-exclusionchromatography）固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

21第21頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月七、親和色譜(AC)

（Affinitychromatograph）原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。22第22頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-4

液相色譜法固定相（stationaryphasesofLC）1.液-液分配及離子對(duì)色譜固定相

（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；23第23頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N24第24頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；25第25頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.液-固吸附色譜法固定相吸附劑種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm。26第26頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.離子交換色譜法固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄膜型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）樹脂類別：（1）陽(yáng)離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）27第27頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.空間排阻色譜法固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。28第28頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-5

液相色譜法流動(dòng)相

（mobilephasesofLC）

（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。1.流動(dòng)相特性29第29頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。30第30頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)31第31頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。32第32頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-6HPLC流程及主要部件

（processandmainassemblyofHPLC）1.流程高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成.33第33頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。往復(fù)式柱塞泵34第34頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)梯度淋洗裝置

外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。35第35頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：36第36頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(4)高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。37第37頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(5)液相色譜檢測(cè)器a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線性范圍大；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。38第38頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月b.光電二極管陣列檢測(cè)器

紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。39第39頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月光電二極管陣列光譜檢測(cè)器可以瞬間實(shí)時(shí)對(duì)流出液進(jìn)行全光譜檢測(cè),使LC能提供的信息量大幅度增加，可提供既能定量又定性的色譜信號(hào)。鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測(cè)池的不是單色光，而是一段紫外波長(zhǎng)上的光?？赏瑫r(shí)得到時(shí)間-波長(zhǎng)-吸收強(qiáng)度※三維色譜圖。40第40頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月41第41頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月光電二極管陣列檢測(cè)器42第42頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月c.示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。43第43頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月d.熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。44第44頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

e.電導(dǎo)檢測(cè)器

電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測(cè)量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。其它檢測(cè)器還包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、極譜等。45第45頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月◆

流路系統(tǒng)（分析單元）：高、低壓流路

◆

電路系統(tǒng)（控制單元）：信號(hào)傳輸與處理

流動(dòng)相供給和輸送進(jìn)樣分離檢測(cè)記錄、數(shù)據(jù)處理色譜工作站（計(jì)算機(jī)）：控制顯示溫度控制收集46第46頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、分離類型選擇

（choiceofseparationtypes）§3-8液相色譜法的應(yīng)用47第47頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、HPLC的應(yīng)用

（applicationofHPLC）1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。

48第48頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器49第49頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、制備型液相色譜

（preparativeliquidchromatography）獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。半制備柱（內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度15～30cm），一次制備量０.1～1mg；1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量；

對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；

超載：進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。50第50頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.液相制備色譜的方法收集組分時(shí)，通常有以下情況：（1）可獲得良好分離：主峰使用制備柱，超載提高效率；（2）兩主成分之間的小組分：超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。51第51頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.制備型液相色譜制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大；采用制備柱；柱后餾分收集器。制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長(zhǎng)50cm。52第52頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§3-10高效毛細(xì)管電泳分析53第53頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、高效毛細(xì)管電泳分析

highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。

毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。54第54頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化

電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少

進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣

有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等；

55第55頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、分離過程

電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。56第56頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月高效毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)57第57頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-19～10-21mol/L）58第58頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、電滲現(xiàn)象與電滲流

5.1電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（簡(jiǎn)稱EOF）。

59第59頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.2HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時(shí)，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。

在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流。60第60頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.3HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；石英毛細(xì)管；帶正電荷，電滲流流向陰極；61第61頁(yè)，課件共71頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.4HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流-