NCAPG對乙型肝炎病毒導(dǎo)致肝癌以及預(yù)后影響

NCAPG對乙型肝炎病毒導(dǎo)致肝癌以及預(yù)后影響

馬維杰李偉成雨濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院山東煙臺264000原發(fā)性肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，也是腫瘤致死的第四大病因[1]。原發(fā)性肝癌按照細(xì)胞分型主要分為肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌、混合型肝癌。其中肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)為肝癌的主要類型，約占全部的75%[2]。肝癌預(yù)后較差，2018年全球肝癌發(fā)病率為9.3/100000，相應(yīng)死亡率為8.2%[1]。流行病學(xué)證據(jù)表明HCC的危險因素受地區(qū)的影響，在發(fā)展中國家，慢性乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染為導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要影響因素[3]。HBV通過將自身DNA在癌癥的早期階段整合到宿主基因組中，誘導(dǎo)基因發(fā)生突變，使肝細(xì)胞對致癌因子敏感，同時HBV可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫細(xì)胞的失衡從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[4-5]。與未感染人群相比，慢性HBV攜帶者患肝癌的終生風(fēng)險高10到25倍[6]。因此如何抑制HBV攜帶者發(fā)展為肝癌患者對預(yù)防HCC的發(fā)生及預(yù)后有著重要的意義。盡管許多參與肝癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的相關(guān)基因和通路被廣泛討論，然而對各種基因和通路之間的機(jī)制關(guān)系仍然比較模糊。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE62232數(shù)據(jù)集，從而確定HBV與肝細(xì)胞癌的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的核心基因。通過GEO2R，分別獲得正常組織和無病因肝癌、正常組織和HBV導(dǎo)致肝癌的DGES，利用string在線數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件構(gòu)建DEGS的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteininteraction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。通過Timerualcan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NCAPG與腫瘤免疫浸潤水平的關(guān)系。對NCAPG進(jìn)行Kaplan-Meier總體生存分析和相關(guān)性分析，最后通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出NCAPG有關(guān)的肝細(xì)胞癌臨床數(shù)據(jù)，證明NCAPG屬于一個獨(dú)立預(yù)后因素。1材料和方法1.1肝細(xì)胞癌微陣列數(shù)據(jù)集采集和處理為了獲得hcc的mRNA表達(dá)集，在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索“l(fā)iver”和“智人”，通過目標(biāo)方向篩選出所需要的數(shù)據(jù)集GSE62232[7](基于GPL570[HG-U133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array)，其中包括10名正常人肝組織，10名HBV感染肝癌患者,15名無病因肝癌患者。其中所有數(shù)據(jù)均由公共數(shù)據(jù)庫獲取，本研究不涉及任何人體及動物實(shí)驗(yàn)。1.2差異基因的鑒別和分析通過GRO2R分別鑒別正常肝組織和HBV肝癌患者、無病因肝癌患者之間的差異基因，P值和差異倍數(shù)(foldchange，F(xiàn)C)選擇默認(rèn)數(shù)值，認(rèn)為當(dāng)P2時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過R軟件和BioConductor軟件包分別篩選之前的差異基因，隨后通過Venn圖檢查交叉基因。從Venn圖中找到目標(biāo)差異基因(在HBV肝癌患者中獨(dú)有的上調(diào)基因)117個。1.3PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及hub基因的篩選通過將篩選出的差異表達(dá)基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫中用于分析蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體，提取出綜合得分>0.9的所有蛋白相互作用(PPI)對，一般認(rèn)為綜合得分越高，基因越相似，PPI網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性越好。最后通過Cytoscape軟件計(jì)算所得的文件，最終選出10個hub基因。1.4hub基因的篩選通過對選中的10個hub基因與癌癥關(guān)聯(lián)性以及對其藥物敏感性的測定，初步選定將NCAPG作為本研究的關(guān)鍵基因。1.5hub基因與腫瘤免疫浸潤水平的關(guān)聯(lián)將選中的hub基因?qū)隩imer中，從中發(fā)現(xiàn)hub基因是否與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平有關(guān)。進(jìn)一步篩選hub基因與其相關(guān)亞群浸潤水平之間的關(guān)系。1.6hub基因的調(diào)控因子為明白hub基因在hcc中的生物學(xué)意義，通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫查找出與hub基因有關(guān)的相關(guān)基因，分析了NCAPG共表達(dá)基因的激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)的富集。1.7對hub基因的GSEA富集分析通過TCGA-GDC數(shù)據(jù)庫下載與LIHC有關(guān)的mRNA信息，篩選出所需要的hub基因，通過運(yùn)用Java、perl、GSEA(4.1.0)繪制富集分析圖，明確hub基因的功能。1.8hub基因的生存分析使用Kaplan-Meier在線數(shù)據(jù)庫對hub基因進(jìn)行生存分析，分別分析總生存期(overallsurvival，OS)、無進(jìn)展生存期(progressionfreesurvival，PFS)，并將其表達(dá)在曲線圖中。1.9hub基因的臨床相關(guān)性分析將hub基因?qū)險ALCAN數(shù)據(jù)庫，分別選擇在不同種族、年齡、性別等方面表達(dá)量差別，進(jìn)一步分析hub基因與肝癌生存分析的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.10hub基因的單、多因素COX回歸通過TCGA-GDC數(shù)據(jù)庫下載與LIHC有關(guān)的臨床信息，通過perl軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)清理，隨后通過perl軟件、R語言對其進(jìn)行單、多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1對DEG的篩選通過對數(shù)據(jù)集GSE62232分析，成功從正常肝組織和HBV肝癌患者對照組中識別出495個DEGs，其中包括178個上調(diào)基因和317個下調(diào)基因。從正常肝組織和不患有HBV肝癌患者對照中識別出241個DEGs，其中包括68個上調(diào)基因和173個下調(diào)基因(表1)。利用在線數(shù)據(jù)庫對GSE62232以P2為截?cái)帱c(diǎn)，確定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEGs進(jìn)行分析，計(jì)算并繪制Venn圖(圖1)。通過Venn圖中分析DEGs之間的交集，發(fā)現(xiàn)有117個DEGs只在HBV相關(guān)肝癌患者中高表達(dá)，156個DEGs只在HBV相關(guān)肝癌患者中低表達(dá)。有7個DEGs只在無病因肝癌患者中高表達(dá)，12個DEGs只在無病因肝癌患者中低表達(dá)。從中選擇將117個DEGs作為下一步研究對象。表1不同表達(dá)基因的聚類圖1不同基因之間的Venn圖。2.2PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及hub基因的篩選使用string數(shù)據(jù)庫來確定117個DEGs的蛋白質(zhì)集合網(wǎng)絡(luò)，通過設(shè)置綜合得分>0.9從而得出115個節(jié)點(diǎn)和74條相互作用(圖2A)。(PPI富集P值<0.05(圖2C)。本研究通過將10個hub基因?qū)隚SCALIte中來發(fā)現(xiàn)與hub基因有關(guān)的藥物敏感性與基因表達(dá)量之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG藥物敏感性較好(圖2D)，因此，把NCAPG作為本次研究的主要基因。2.3NCAPG與腫瘤免疫浸潤水平的關(guān)聯(lián)將選中的NCAPG導(dǎo)入Timer中，從中發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的表達(dá)可能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在腫瘤中浸潤水平，而與CD8+T細(xì)胞無關(guān)(圖3A)。同時本研究通過針對年齡、性別、種族和腫瘤階段等因素進(jìn)行了多元Cox回歸，本研究確定了免疫細(xì)胞的浸潤程度與患者的預(yù)后有關(guān)，其中CD4+T細(xì)胞浸潤率最高的20%的患者的中位生存時間低于最低20%的患者。這表明，CD4+T細(xì)胞可能通過NCAPG在LICH腫瘤表達(dá)中起著重要的作用(圖3B)。本研究探討了細(xì)胞拷貝數(shù)與免疫浸潤之間的關(guān)系，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)NCAPG處于高度擴(kuò)增的狀態(tài)下可以影響CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的浸潤情況(P<0.05)(圖3C)。為進(jìn)一步表明NCAPG與CD+T細(xì)胞之間的關(guān)系，運(yùn)用R語言對其進(jìn)行進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)，NCAPG與CD4+T細(xì)胞中的Th2細(xì)胞具有高度正相關(guān)性，與DC、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等呈負(fù)相關(guān)性(圖3D)。A.是由117個DEGs通過設(shè)置綜合得分>0.9從而得出115個節(jié)點(diǎn)和74條相互作用的蛋白質(zhì)集合網(wǎng)；B.用Cytoscape(v3.7.2)根據(jù)連接度篩選出PPI中的前10個hub基因。已鑒定的BUB1、CDC20、NDC80、BUBU1B、CENPF、BIRC5、NUF2、TTK、NCAPG和MELK等10個hub基因從(紅色高度值到黃色低度值)；C.箱圖表示所選基因在正常組織和腫瘤組織中的差異表達(dá)情況從左到右箱圖分別表示BUB1、CDC20、NDC80、BUBU1B、CENPF、BIRC5、NUF2、TTK、NCAPG、MELK在腫瘤組織和正常組織之間的表達(dá)情況；D.CDC20、BUB1、CENPF、BUB1b、NCAPG、NDC80、TTK、MELK、BIRC5等10個hub基因與不同藥物敏感性的關(guān)系。A.通過TIMER2.0對NCAPG進(jìn)行相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤情況分析；B.NCAPG和相關(guān)浸潤細(xì)胞對HCC預(yù)后的影響；C.NCAPG在深度缺失、臂水平缺失、二倍體/正常、臂水平增益和高擴(kuò)增等情況下在HCC中免疫細(xì)胞浸潤水平的比較；D.NCAPG與相關(guān)免疫細(xì)胞在HCC中的表達(dá)關(guān)聯(lián)情況。2.4HCC中NCAPG的調(diào)控因子為了進(jìn)一步探索HCC中NCAPG的調(diào)控因子，本研究通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析了NCAPG及其相關(guān)共表達(dá)基因的激酶，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子(TF)的富集(表2)。前5個最重要的激酶主要與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)，polo樣激酶1(PLK1)，極光激酶B(AURKB)，檢查點(diǎn)激酶1(CHEK1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)相關(guān)。除CDK2外，其余激酶基因均高度表達(dá)于腫瘤組織中。轉(zhuǎn)錄因子主要富集在E2F轉(zhuǎn)錄因子組中。miRNA并未發(fā)現(xiàn)明顯富集。表2與NCAPG相關(guān)的激酶，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的富集2.5NCAPG的GSEA富集分析為明確NCAPG在體內(nèi)的主要功能，通過GSEA軟件對NCAPG進(jìn)行富集分析。通過下載與LIHC有關(guān)的mRNA信息，繪制富集分析圖(圖4)。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG主要在細(xì)胞周期、RNA降解、剪接體、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、胰島素信號通路、核苷酸切除修復(fù)等通路中高表達(dá)，在補(bǔ)體與凝血反應(yīng)、脂肪酸代謝、初級膽汁酸生物合成、藥物代謝細(xì)胞色素p450、纈氨酸和亮氨酸降解、色氨酸代謝等通路中低表達(dá)。2.6Hub基因的生存分析將NCAPG導(dǎo)入Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫中獲得預(yù)后信息。本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的異常表達(dá)水平與HCC的預(yù)后不良有關(guān)，在NCAPG高表達(dá)組中的OS、PFS均低于低表達(dá)組，P<0.05(圖5A)。圖4NCAPG的GSEA富集分析A.TCGALIHC隊(duì)列中的總生存期(OS)、無病生存期(DFS)；B.基于性別、年齡和其他標(biāo)準(zhǔn)(UALCAN)分層的HCC患者亞組中的NCAPG轉(zhuǎn)錄。箱圖顯示了NCAPG在LIHC樣品亞組中的表達(dá)。從左到右分別顯示正常個體或1、2、3或4期LIHC患者中NCAPG的相對表達(dá)。正常、高加索人、非裔美國人、亞洲LIHC患者中NCAPG的相對表達(dá)。正常個體或具有1、2、3或4級腫瘤的LIHC患者中NCAPG的相對表達(dá)。正常個體和男性或女性LIHC患者中NCAPG的相對表達(dá)。任何年齡的正常個體或21～40、41～60、61～80或81～100歲的LIHC患者中NCAPG的相對表達(dá)。正常和LIHC樣本中NCAPG的相對表達(dá)。中心標(biāo)記是中位數(shù)；盒子的邊緣是第25個和第75個百分位數(shù)；C.多因素Cox回歸用于評估年齡、性別、登記、階段、TNM分期以及NCAPG對于HCC預(yù)后影響。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。2.7NCAPG基因的臨床相關(guān)性及其臨床數(shù)據(jù)分析在UALCAN數(shù)據(jù)庫中分別選擇在不同種族、年齡、性別、疾病階段、甲基化等方面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在HCC患者組中NCAPG的表達(dá)量均高于正常對照組(圖5B)。因此，本研究認(rèn)為，NCAPG的表達(dá)可以作為一個潛在的HCC的診斷指標(biāo)。由于單基因分析中可因人群分布差異從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，因此，通過COX回歸進(jìn)行臨床樣本的校正，排除相關(guān)差異。通過TCGA—GDC下載與LIHC有關(guān)的臨床信息，從中得出377例文件，通過perl軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)清理，從中得出HCC的377例臨床數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，從中選擇出231例所有信息均未失訪的樣品，隨后通過perl軟件、R語言對其進(jìn)行單、多因素分析(圖5C)。3討論NCAPG為編碼凝縮蛋白復(fù)合物的亞基，負(fù)責(zé)有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體的凝結(jié)和穩(wěn)定[8]。編碼蛋白的磷酸化激活凝縮蛋白復(fù)合物。先前的研究表明NCAPG為肝細(xì)胞癌的重要癌基因[9]，但是對于導(dǎo)致NCAPG上調(diào)的病因以及其機(jī)制仍不清楚。在本研究中，主要通過生物信息分析技術(shù)從GEO數(shù)據(jù)庫中找出正常組織和無病因肝癌、正常組織和HBV導(dǎo)致肝癌的DEGs圖譜，并從中篩選出在HBV相關(guān)肝癌中表達(dá)的117個上調(diào)的DEGS和156個下調(diào)的DEGs，從上調(diào)的DEGS中通過PPI蛋白質(zhì)聚合體網(wǎng)絡(luò)中選擇前10位的hub基因。通過KEGG富集分析本研究發(fā)現(xiàn)這10個hub基因最顯著的富集途徑為細(xì)胞周期。而細(xì)胞周期紊亂是導(dǎo)致癌細(xì)胞異常增殖的主要原因[10]。正常細(xì)胞的增殖依賴于接收到適當(dāng)?shù)挠薪z分裂信號，同時細(xì)胞只有在G1期結(jié)束時才進(jìn)入細(xì)胞周期，細(xì)胞周期蛋白驅(qū)動正常細(xì)胞進(jìn)入分裂周期，并通過激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶來調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控細(xì)胞生長。然而細(xì)胞周期蛋白的上移導(dǎo)致細(xì)胞生長周期紊亂以及細(xì)胞凋亡失調(diào)[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NCAPG基因的表達(dá)可能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在腫瘤中浸潤水平，而與CD8+T細(xì)胞無關(guān)。腫瘤組織中的免疫細(xì)胞與臨床預(yù)后密切相關(guān)，有可能作為藥物靶標(biāo)來提高患者的預(yù)后率。本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤相關(guān)浸潤細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞高表達(dá)的預(yù)后較差。本研究是否可以認(rèn)為NCAPG通過介導(dǎo)T細(xì)胞中的某一途徑從而使T細(xì)胞免疫作用發(fā)生改變，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化，也有可能的解釋是肝癌患者的宿主免疫系統(tǒng)將NCAPG識別為新抗原，從而導(dǎo)致T細(xì)胞聚集，但為何CD4+T細(xì)胞聚集卻導(dǎo)致預(yù)后較差，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確認(rèn)NCAPG與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，本研究通過篩選實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對其進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NCAPG在HCC中與Th2細(xì)胞具有高度相關(guān)性、與CD8+T細(xì)胞具有負(fù)相關(guān)性且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Th2細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞中的一種，是一種能夠分泌Th2型細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素IL-4、IL-5、IL-10等)的T細(xì)胞亞型[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NCAPG高表達(dá)時促進(jìn)了Th2細(xì)胞的表達(dá)，抑制了Th1細(xì)胞的表達(dá)從而導(dǎo)致Th1/Th2失衡。Th1/Th2失衡可促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC的概率[15-16]。Budhu[17]等發(fā)現(xiàn)，在HBV+的HCC患者中，與孤立性HCC相比，存在靜脈轉(zhuǎn)移的HCC患者中促炎性Th1樣細(xì)胞因子產(chǎn)生較少，抗炎性Th2樣細(xì)胞因子產(chǎn)生較多，存在Th1/Th2失衡。這也可能是NCAPG高表達(dá)時預(yù)后較差的原因之一。CD8+T細(xì)胞識別源自吞噬和蛋白水解裂解的HBV蛋白的病毒肽，激活B細(xì)胞，并分泌IFN-γ和TNF-α，從而抑制HBV的復(fù)制和基因表達(dá)[5,18]。Wang[19]等研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙肝病毒患者體內(nèi)的HBV特異性CD8+T細(xì)胞存在功能耗竭的情況，當(dāng)在急性免疫激活狀態(tài)下再度感染HBV時，特異性CD8+T細(xì)胞不能有效的發(fā)揮抗病毒能力，表明衰竭的特異性CD8+T細(xì)胞與慢性HBV復(fù)制和由此進(jìn)一步導(dǎo)致的疾病進(jìn)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NCAPG高表達(dá)時CD8+T細(xì)胞表達(dá)量減少，NCAPG可能在慢性肝炎的過程中誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的耗竭過程，從而促進(jìn)HBV的復(fù)制，導(dǎo)致HCC的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體可恢復(fù)HCC中CD8+T細(xì)胞的功能[20]，那抗PD-1抗體是否可以作用于NCAPG高表達(dá)的患者中從而降低HBV患者向HCC轉(zhuǎn)換的比值，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。Xiao[21]研究表明，NCAPG高表達(dá)與多種腫瘤如HCC、乳腺癌、肺癌或卵巢癌的不良生存密切相關(guān)。這是否可以認(rèn)為NCAPG基因作用于這些癌癥的共同通路中，這對研究NCAPG作用機(jī)制提供了一定的方向。本研究通過研究NCAPG共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)，NCAPG與包括CDK1，PLK1，AURKB，CHEK1和CDK2在內(nèi)的激酶網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。這些激酶對于調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性、有絲分裂的進(jìn)行、發(fā)展以及細(xì)胞周期具有重大意義，并在LIHC中存在差異表達(dá)和影響存活預(yù)后。實(shí)際上，CDK1除了調(diào)控細(xì)胞分裂以及細(xì)胞分化等功能外，還可以維持胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳特性[22]。CDK1可作為有絲分裂期間巨噬細(xì)胞自噬的主要調(diào)節(jié)劑，在有絲分裂期間抑制巨噬細(xì)胞的自噬作用，從而維持基因組的穩(wěn)定性[23]。本研究通過對NCAPG單獨(dú)基因的GSEA分析發(fā)現(xiàn)，其基因高表達(dá)時可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用，可能會導(dǎo)致CDK1功能發(fā)生改變，進(jìn)而影響DNA的復(fù)制、修復(fù)等方面。丙型肝炎病毒可誘導(dǎo)AURKB活性下降，導(dǎo)致HCV感染性增大[24]。本研究通過GSEA分析也發(fā)現(xiàn)了NCAPG上調(diào)可以影響剪切體形態(tài)，本研究有理由相信AURKB-Sv1可能是由