大腸桿菌高活性氨基酸生物合成途經(jīng)研究

研究目的：汽油替代品：高能量密度、低吸濕性、辛烷值傳統(tǒng)生物燃料&高級(jí)醇；直鏈醇&支鏈醇研究菌體：大腸桿菌方法技術(shù)：代謝工程：高活性氨基酸生物合成途經(jīng)+埃利希途徑（Ehrlichpathway）葡萄糖一2-酮酸中間體一高級(jí)醇（異丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇）實(shí)驗(yàn)部分：一、異丁醇前期實(shí)驗(yàn)：1）2-酮酸是氨基酸生物合成途徑的中間產(chǎn)物；通過2-酮基酸脫羧酶（KDC）轉(zhuǎn)化為醛；通過醇脫氫酶（ADH）轉(zhuǎn)化為醇類。通過實(shí)驗(yàn)，測(cè)定Kivd是所有測(cè)試酶中活性最高且最具有多樣性的KDC，ADH選用乙醇脫氫酶2，二者均來(lái)自酵母菌。2）不同種類的2-酮酸（表2）加入到表達(dá)Kivd的大腸桿菌培養(yǎng)菌中會(huì)將相應(yīng)醇類的產(chǎn)量提高2~23倍。特種2-酮酸的供應(yīng)也明顯地削減了其他醇類的產(chǎn)量。這些結(jié)果均表明增加特種2-酮酸的量可以提高醇類的產(chǎn)量和選擇性。大腸桿菌已有的代謝途徑被轉(zhuǎn)基因改造，增加特種2-酮酸的產(chǎn)量，可以生產(chǎn)出期望的醇類。設(shè)計(jì)菌株：1）為合成異丁醇，質(zhì)粒內(nèi)PLIacOI啟動(dòng)子控制的ilvIHCD基因被過度表達(dá)以增大2-酮異戊酸生物合成量。2）強(qiáng)化ilv合成途徑和乙醇合成途徑（Kivd和Adh2）。菌株可產(chǎn)生出23mM異丁醇，這約是普通菌株產(chǎn)量的五倍3）進(jìn)一步提高異丁醇的產(chǎn)量，需要?jiǎng)h除控制合成副產(chǎn)物的基因，包括adhE，IdhA，frdAB，fnr和pta。這些基因的刪除可提高用于ilvIHCD合成途徑的丙酮酸的量。敲出基因后的菌株產(chǎn)生了30mM異丁醇。4）選用枯草芽抱桿菌的alsS基因取代大腸桿菌的ilvIH基因。相比于大腸桿菌更偏向酮丁酸的ilvIH基因，alsS基因?qū)Ρ猁}有更強(qiáng)的親和力。采用alsS途徑的菌株可產(chǎn)生約50mM的異丁醇。5）為進(jìn)一步增加丙酮酸鹽的量，pfIB基因被敲出。在這些操作的綜合作用下，可以在微好氧條件下使異丁醇的產(chǎn)量達(dá)到約300mM（22g/l）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過此種方法由葡萄糖獲得了高產(chǎn)量、高選擇性的異丁醇二、正丁醇1）1-正丁醇的前提2-酮基戊酸乙酯不是大腸桿菌的代謝物。，作者嘗試以與亮氨酸生物合成途徑相似的方法，以一種分子比2-ketovalerate少一個(gè)甲基的更小的分子2-酮丁酸為底物，合成2-ketovalerate。2-酮丁酸可以通過由ilvA基因編碼的蘇氨酸脫水酶作用蘇氨酸生成。2）為進(jìn)一步提高1-丁醇的產(chǎn)量，編碼二羥酸脫水酶的基因ilvD被敲除。二羥酸脫水酶能夠同時(shí)產(chǎn)生2-酮基異戊酸（亮氨酸和纈氨酸的前體）和2-酮基3-甲基戊酸（異亮氨酸的前體）。此種操作有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，ilvD基因的敲除避免了leuABCD代謝途徑的自然底物2-酮基異戊酸的生成，進(jìn)而抑制了目的產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)底物。其次，ilvD基因的敲除避免了Kivd的競(jìng)爭(zhēng)底物2-酮酸-3-甲基-戊酸和2-酮酸-4-甲基戊酸的產(chǎn)生。故而ilvD基因的敲除進(jìn)一步增加了1-丁醇的產(chǎn)量。三、提高耐受性為了探索耐受性的可提高程度，我們對(duì)于正丁醇耐受性的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)，原生的大腸桿菌對(duì)于正丁醇的耐受性為1.5%。然而，菌株在正丁醇濃度不斷增加的環(huán)境下進(jìn)行傳代培養(yǎng)五代之后，便會(huì)出現(xiàn)對(duì)正丁醇的耐受性達(dá)到2%的基因突變菌株（補(bǔ)充材料中的圖4）。這種菌株的耐受性可達(dá)到與1-丁醇的原生生產(chǎn)者相當(dāng)或甚至優(yōu)于原生生產(chǎn)者。證明大腸桿菌可以適應(yīng)長(zhǎng)鏈醇類的高濃度環(huán)境。之后還可以運(yùn)用諸如全轉(zhuǎn)錄工程（gTME）等其他的方法進(jìn)一步提高耐受性。優(yōu)勢(shì)：1、本方法使用大腸桿菌作為研究菌體，但這種方法可以在諸如釀酒酵母菌的其他溫和菌體上實(shí)現(xiàn)。這些寄主微生物生長(zhǎng)速率快，且為兼性厭氧菌，這為大規(guī)模生產(chǎn)