病毒學(xué)及檢驗(yàn)

病毒學(xué)及檢驗(yàn)

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概念：病毒(Virus，V)是一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積微小、只含一種核酸、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生、只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式增殖和抵抗力特殊的非細(xì)胞型微生物。病毒在醫(yī)學(xué)上的重要意義：1.分布廣泛。在人、動(dòng)物、植物和細(xì)胞體內(nèi)均有寄生；2.可致人類多種(80%)傳染病，且傳染性強(qiáng)，尚可引起世界性大流行。概述2整理ppt3.與某些腫瘤性疾病有關(guān)。HBV—原發(fā)性肝癌；HSV-Ⅱ—宮頸癌；EBV—鼻咽癌。4.與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)。5.與先天性感染有關(guān)，可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸形或死胎。HIV、HSV-Ⅱ、HMCV、風(fēng)疹V。6.從分子水平研究病毒學(xué)及檢驗(yàn)，將對(duì)病毒性疾病的診斷和防治產(chǎn)生重大意義。目前病毒學(xué)已成為多學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)。3整理ppt一、病毒的基本性狀（一）大小與形態(tài)完整的具有感染性的病毒叫病毒體(viron)，病毒的大小就是指病毒體的大小。

1.病毒大小在20～300nm之間。大型病毒直徑在200～300nm之間，在普通光鏡下勉強(qiáng)可見；中型病毒直徑在100nm左右，為大多數(shù)病毒；小型病毒直徑在20～30nm之間。病毒體積微小，絕大多數(shù)須用電鏡放大成千上萬倍才能清楚可見。4整理ppt2.病毒的形態(tài)⑴球形：絕大多數(shù)動(dòng)物病毒；⑵桿形：植物病毒，如煙草花葉病毒；⑶磚形：痘類病毒—牛痘天花病毒；⑷彈形：狂犬病毒；⑸蝌蚪形：噬菌體。（二）結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成

1.基本結(jié)構(gòu)——核心、衣殼。⑴核心(core)：位于病毒中心，為核酸—RNAorDNA。尚有少量功能蛋白—核酸多聚酶、轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。5整理ppt

病毒核酸的功能：決定病毒的遺傳變異、復(fù)制和感染性，也可作為研究遺傳工程的工具。⑵衣殼(capsid):包圍在病毒核心外面的一層蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由許多蛋白質(zhì)亞單位(殼微粒)組成。在電鏡下殼微粒有三種排列形式—螺旋對(duì)稱(流感病毒)、20面體立體對(duì)稱(乙腦病毒)和復(fù)合對(duì)稱(噬菌體頭部為20面體立體對(duì)稱，尾部為螺旋對(duì)稱)。病毒衣殼的功能：保護(hù)病毒核酸，參與病毒感染過程，具有抗原性。

6整理ppt2.輔助結(jié)構(gòu)——包膜、刺/纖突。⑴包膜(envelope):包圍在病毒核衣殼外面的雙層膜，由蛋白、多糖和類脂組成。以“出芽”方式釋放時(shí)，病毒從宿主細(xì)胞膜、核膜或空泡中獲得的。包膜的功能：保護(hù)核衣殼，維護(hù)病毒結(jié)構(gòu)的完整性；具有與宿主細(xì)胞親和及融合的性能，與病毒感染有關(guān)；與病毒的種型特異性(抗原性)有關(guān)。⑵刺/纖突(spike):病毒的包膜表面常有不同形狀的觸須樣突出。功能：與病毒的血凝性和吸附有關(guān)。7整理ppt（三）病毒的增殖

1.方式——復(fù)制周期病毒本身缺乏新陳代謝完整的酶系統(tǒng)，不能獨(dú)立進(jìn)行物質(zhì)代謝，須由宿主細(xì)胞提供病毒合成代謝所需的原材料、能量和場(chǎng)所才能進(jìn)行增殖。病毒的一個(gè)復(fù)制周期包括：吸附→穿入→脫殼→生物合成→裝配與釋放(①破胞釋放：為無包膜病毒；②芽生方式：為有包膜病毒；③其他方式：巨細(xì)胞病毒通過細(xì)胞間橋或細(xì)胞融合，致癌病毒通過基因整合方式隨細(xì)胞分裂而傳代)。感染病毒的細(xì)胞的結(jié)局：①形成完整的傳染性顆粒；②部分基因整合入染色體，不產(chǎn)生子代；③形成缺陷病毒。8整理ppt2.病毒的異常增殖缺陷病毒(defectivevirus):指病毒基因組不完整或某一基因位點(diǎn)改變而不能進(jìn)行正常增殖的病毒；但能干擾同種成熟病毒體進(jìn)入細(xì)胞，故又稱缺陷干擾顆粒(defectiveinterferingparticles，DIP)。缺陷病毒+輔助病毒→能正常增殖。頓挫感染(abortiveinfection):病毒進(jìn)入細(xì)胞但不能合成其本身成分，或能合成其本身成分但不能裝配與釋放病毒體。被感染的細(xì)胞稱非容納細(xì)胞(non-permissivecell)，因?yàn)槠洳荒転椴《驹鲋程峁┧璧拿浮⒛芰考氨匾煞帧?整理ppt3.病毒的干擾現(xiàn)象（1）概念：兩種病毒同時(shí)感染同一細(xì)胞，可出現(xiàn)一種病毒抑制另一種病毒的現(xiàn)象?？砂l(fā)生在異種病毒之間，也可可發(fā)生在同種同型不同株病毒之間(流感病毒的自身干擾)。（2）產(chǎn)生干擾現(xiàn)象的原因①與病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(interferon，IFN)有關(guān)，IFN能干擾病毒的mRNA的復(fù)制；②干擾病毒的吸附或改變宿主細(xì)胞的代謝途徑；③缺陷病毒所引起的干擾。（3）干擾現(xiàn)象的臨床意義①可阻止宿主細(xì)胞發(fā)病，也可中止感染，使疾病痊愈；②應(yīng)用病毒性疫苗時(shí)，應(yīng)防止干擾現(xiàn)象產(chǎn)生。10整理ppt（四）病毒的抵抗力與變異病毒對(duì)各種理化因素的敏感性強(qiáng)弱因病毒的種類而異。了解理化因素對(duì)病毒的影響，對(duì)阻止病毒感染，分離病毒及疫苗制備等均有十分重要的意義。

1.抵抗力（1）物理因素：①耐冷不耐熱，一般病毒60℃×30min滅活(HBV100℃×10min)；-70℃以下或液氮(-196℃)中長期存活(數(shù)月—數(shù)年)。②對(duì)射線(x、

)和紫外線均敏感，但不能用紫外線殺毒法(可光復(fù)活)來制備滅菌疫苗。③對(duì)酸堿度的敏感性因病毒種類而異：腸道病毒耐酸(在pH3.0—5.0時(shí)穩(wěn)定)，而呼吸道病毒對(duì)酸敏感(鼻病毒在pH3.0—5.0時(shí)迅速滅活)。故可用耐酸試驗(yàn)來鑒別這兩種病毒。11整理ppt

（2）化學(xué)因素：病毒對(duì)化學(xué)因素的抵抗力一般較細(xì)菌強(qiáng)。①耐甘油：可用50%中性甘油緩沖液鹽水保存送檢標(biāo)本。②脂溶劑：有包膜的對(duì)脂溶劑(乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽等)敏感，使病毒滅活失去吸附能力，但對(duì)無包膜的病毒無作用。故可用耐乙醚試驗(yàn)鑒別病毒有無包膜。③化學(xué)消毒劑：病毒對(duì)各種氧化劑、鹵素和醇類均敏感，如H2O2、漂白粉、甲醛、過氧乙酸、次氯酸鹽、碘酒、酒精和甲醇等。④抗生素不敏感。⑤中草藥(板藍(lán)根、大青葉、大黃和七葉一枝化)對(duì)某些病毒有一定的抑制作用。12整理ppt2.變異大多數(shù)病毒有遺傳穩(wěn)定性，但也有一定的變異性。病毒的體積微小，表面積大，易受周圍環(huán)境因素的影響而發(fā)生變異。由于抗原性的改變，人群普遍缺乏免疫力。可引起大流行，如SARS和禽流感等。另外，通過人工方法使病毒株毒力減弱，而抗原性不變，可制備各種疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、牛痘苗、乙型腦炎疫苗和狂犬疫苗等。13整理ppt（五）病毒的分類和常見病毒病毒分類的主要依據(jù)：基因特征、形態(tài)大小、結(jié)構(gòu)和對(duì)脂溶劑的敏感性等。（1）1995年國際病毒分類委員會(huì)將病毒分為三類：DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。（2）根據(jù)感染宿主不同，分為動(dòng)物病毒、植物病毒和細(xì)菌病毒(噬菌體)。

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（3）根據(jù)感染途徑和臨床特點(diǎn)分類：①呼吸道病毒——流感V、副粘V、鼻V、冠狀V、腺V、風(fēng)疹V和呼腸V。②腸道病毒——polioV、CoxV、ECHOV、rotaV和新腸道型。③肝炎病毒——HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV和TTV。④蟲媒病毒——流行性乙型腦炎V。⑤皰疹病毒——EBV、CMV、HSV和VZV。⑥狂犬V、漢坦V、新疆出血熱V、登革V和HIV。15整理ppt二、病毒的傳染與免疫(一)病毒感染的類型

1.隱性感染(inapparentinfection)或亞臨床感染(subclinicalinfection)：V→機(jī)體→無臨床癥狀，可獲得免疫，也可成為重要的傳染源。

2.顯性感染(apparentinfection)：V→機(jī)體→組織損傷→臨床癥狀。按病程長短和發(fā)病快慢，分急性感染和持續(xù)感染。

(1)急性感染(acuteinfection):起病急，病程短，痊愈后病毒在體內(nèi)消失。如流感V、麻疹V、水痘V和乙腦V等?！?6整理ppt(2)持續(xù)感染：病毒在體內(nèi)長期存在。①慢性感染(chronicinfection):急性感染后，機(jī)體內(nèi)病毒未完全清除，并不斷排除體外，病毒易分離培養(yǎng)和檢測(cè)，如慢乙肝。②潛伏感染(latentinfection)：急性或隱性感染后，病毒存于一定組織或細(xì)胞中，與機(jī)體保持平衡，無臨床癥狀，也檢測(cè)不到病毒；當(dāng)機(jī)體某些條件改變(免疫力↓或理化因子刺激)時(shí)，潛伏的病毒又活躍起來，有臨床癥狀，病毒又能檢測(cè)，如水痘。③慢發(fā)病毒感染(slowvirusinfection)：潛伏期更長(數(shù)年—數(shù)十年)，無臨床癥狀，也檢測(cè)不到病毒；但病毒在由少到多的緩慢增殖，逐漸增多導(dǎo)致死亡，如麻疹。17整理ppt(二)病毒感染的途徑和傳播方式1.病毒感染的途徑水平傳播：個(gè)體間的傳播V→機(jī)體垂直傳播：母嬰間的傳播常見感染途徑：呼吸道、消化道、媒介昆蟲叮咬、動(dòng)物咬傷、接觸和經(jīng)胎盤。

HBV和HIV可經(jīng)多種途徑感染！18整理ppt2.病毒感染的傳播方式

(1)局部播散：流感V、鼻V。

(2)經(jīng)淋巴和血液擴(kuò)散：V→局部增殖→淋巴管→血(第一次V血癥)→單核-巨噬系統(tǒng)(肝、脾和淋巴結(jié))增殖→血(第二次V血癥)→靶器官→病變和臨床癥狀。

(3)經(jīng)神經(jīng)通道播散：狂犬V神經(jīng)系統(tǒng)→腦海馬溝回病變。神經(jīng)纖維19整理ppt(三)病毒的致病機(jī)制

殺細(xì)胞效應(yīng)

細(xì)胞膜改變1.病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接損傷作用細(xì)胞融合，出現(xiàn)新抗原細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成包涵體與染色體畸形

包涵體(inclusionbody):某些病毒感染宿主細(xì)胞后在胞漿和胞核中形成圓形或卵圓形的普通光鏡下可見的斑塊狀物質(zhì)。不同病毒形成的包涵體的形狀、大小、數(shù)量、所處的位置和染色性(H-E)均不同。有助于病毒感染的早期快速診斷。2.免疫反應(yīng)引起的病理損傷可通過體液免疫、細(xì)胞免疫和直接破壞/損傷免疫細(xì)胞的反應(yīng)(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型變態(tài)反應(yīng))引起免疫病理損傷。20整理ppt(四)病毒感染與腫瘤通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)某些腫瘤的發(fā)生與病毒有關(guān)，但對(duì)人類的作用尚處于研究階段。逆轉(zhuǎn)錄病毒C型T細(xì)胞白血病(淋巴瘤)。逆轉(zhuǎn)錄病毒B型乳腺癌。EB病毒(皰疹V-4型)Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病、白血病、淋巴瘤。HSV-Ⅱ、人乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌。HBV原發(fā)性肝癌。HPV傳染性軟疣、尖銳濕疣。21整理ppt(五)病毒的免疫1.非特異性免疫：IFN、M

、NK。干擾素(interferon，IFN)：是一種由病毒或其它誘生劑使人或動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒活性的糖蛋白。

Ⅰ型：IFN

(白細(xì)胞產(chǎn)生)、IFN

(成纖維細(xì)胞產(chǎn)生)；

Ⅱ型：IFN

(PHA等各種抗原誘導(dǎo)Th產(chǎn)生)。分類性質(zhì)56℃×30’pH2.0抗病毒抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)Ⅰ型穩(wěn)定穩(wěn)定強(qiáng)弱弱Ⅱ型不穩(wěn)定不穩(wěn)定弱強(qiáng)強(qiáng)22整理pptIFN的特性：①無特異性，有廣譜抗病毒的作用；有種屬特異性；②通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白來抑制病毒的復(fù)制，它不是抗體，對(duì)人體無害；③有抑制細(xì)胞分裂、成熟和分化的作用，有治療腫瘤的作用；④對(duì)熱(37℃)、酸堿(pH2～11)較穩(wěn)定，對(duì)紫外線、蛋白酶和胰酶敏感，對(duì)脂酶和核酸酶不敏感。

IFN的實(shí)際意義：有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。

23整理ppt2.特異性免疫體液免疫：中和抗體、IgG介導(dǎo)促進(jìn)作用、補(bǔ)體結(jié)合抗體能促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬作用。細(xì)胞免疫：NK、CTL(特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞)、淋巴因子等作用。尚有自身免疫反應(yīng)等作用。病毒為細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，抗體免疫作用不大，因此主要靠細(xì)胞免疫。除了引起正常免疫保護(hù)外，尚可導(dǎo)致一定的免疫病理作用。特點(diǎn)：型別單一，抗原性穩(wěn)定。有病毒血癥的感染，病后免疫力持久或終身免疫，如麻疹、脊灰和乙腦等；反之，則免疫短暫，如鼻V、流感V。病毒以細(xì)胞免疫為主，體液免疫和細(xì)胞免疫協(xié)同作戰(zhàn)。24整理ppt三、病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷(一)標(biāo)本采集與運(yùn)送1.盡早(疾病初期或急性期)采集適當(dāng)部位的標(biāo)本；2.立即接種或冷藏送檢，或加50%入甘油或10%二甲亞砜-70℃保存；3.采雙份血清：急性期和恢復(fù)期各一份，同時(shí)測(cè)抗體，效價(jià)呈4倍以上增高有診斷價(jià)值；4.嚴(yán)防病毒擴(kuò)散：盛標(biāo)本的容器不易破損或泄露，專人送檢；5.應(yīng)填寫病人姓名、年齡、性別、臨床癥狀、取樣部位和免疫接種等詳細(xì)情況，易于當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)調(diào)查。

25整理ppt(二)病毒的檢驗(yàn)方法1.病毒的分離培養(yǎng)：人工提供活的易感組織細(xì)胞。(1)組織培養(yǎng)：把離體的活組織或分散的活細(xì)胞，在體外人工控制的條件下讓其生長繁殖的一種技術(shù)。包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和器官培養(yǎng)，其中單層細(xì)胞培養(yǎng)最為常用。原代細(xì)胞：HEK、MK細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞：Hela、Hep-2、KB、Vero

二倍體細(xì)胞：WI-38

(2)

雞胚接種

(3)動(dòng)物接種26整理ppt2.病毒的鑒定

(1)初步鑒定：

①根據(jù)病毒感染組織細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffectCPE)對(duì)雞胚的敏感性、對(duì)動(dòng)物的感染范圍或潛伏期與癥狀可初步判斷病毒的存在與否、是哪類病毒；②紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)；③干擾作用：一種病毒感染細(xì)胞后，可干擾另一種病毒進(jìn)入同一細(xì)胞增殖。這種干擾現(xiàn)象可被相應(yīng)病毒的特異抗體所抑制，稱之為干擾抑制現(xiàn)象；④理化性狀測(cè)定：電鏡觀察大小和形態(tài)；乙醚敏感試驗(yàn)?zāi)退嵩囼?yàn)。27整理ppt(2)最后鑒定：血清學(xué)鑒定采急性期和恢復(fù)期雙份血清，同時(shí)測(cè)抗體的效價(jià)，觀察抗體的動(dòng)態(tài)變化，協(xié)助病毒性疾病的診斷。若IgM↑，表示近期感染或疾病處于活動(dòng)狀態(tài)；若IgG效價(jià)呈4倍以上升高，可作為一種輔助診斷指標(biāo)。常用的血清學(xué)方法：中和試驗(yàn)；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；血凝抑制試驗(yàn)；免疫熒光試驗(yàn)；ELISA；乳膠凝集試驗(yàn)；間接血凝試驗(yàn)。28整理ppt①中和試驗(yàn)

是將病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗(yàn)。

Ⅰ、固定病毒(100TCID50)，稀釋血清，測(cè)Ab效價(jià)。兩次效價(jià)相差4倍以上有診斷意義。TCID50：50%組織細(xì)胞感染的病毒劑量(50%TissuecellinfectivedoseTCID50)。

Ⅱ、固定血清(1:20或1:40)，稀釋病毒，求中和指數(shù)。中和抗體為IgG

，出現(xiàn)晚，維持時(shí)間長，多用于V的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。29整理ppt②補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

五種成分，兩個(gè)系統(tǒng)。結(jié)果：溶血為陰性，不溶血為陽性。補(bǔ)體結(jié)合抗體為IgM，出現(xiàn)早，消失快，可用于病毒感染的早期診斷。③血凝抑制試驗(yàn)V+RBC→RBC凝集；V