hiv-gag病毒樣顆粒疫苗免疫鼠血清免疫效果的研究

hiv-gag病毒樣顆粒疫苗免疫鼠血清免疫效果的研究

1981年首次發(fā)現(xiàn)這種疾病，共有1400萬(wàn)人死亡，疫情患者人數(shù)接近5000萬(wàn)人。我國(guó)自1994年后HIV感染進(jìn)入快速增長(zhǎng)期,以B、C亞型為主,估計(jì)到2010年感染者可能突破1000萬(wàn)人,所以對(duì)HIV-1感染的預(yù)防以及與預(yù)防相關(guān)的問題應(yīng)該有一個(gè)全面的評(píng)價(jià),但最實(shí)際的需要是證明一種或幾種有希望的候選疫苗能夠進(jìn)行人體試用。對(duì)暴露于HIV-1的個(gè)體,包括未采取保護(hù)的性伴侶、靜脈途徑的吸毒者和醫(yī)務(wù)工作者的自然史研究發(fā)現(xiàn),人的機(jī)體的確產(chǎn)生了保護(hù)性免疫應(yīng)答。HIV-1自然史的許多研究表明,Th1型病毒特異性的細(xì)胞介導(dǎo)免疫與免疫保護(hù)相關(guān)。其它因子如γ干擾素(IFN-γ)、β-趨化因子對(duì)遭HIV-1感染有保護(hù)作用,其中包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性和CD8病毒抑制活性起重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室選用中國(guó)流行的HIV-1B、C亞型代表株,將其gag和gp120的V3區(qū)插入gag即gag-V3,以VLP形式在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。VLP疫苗是目前最有希望的疫苗之一,它與天然病毒十分接近,抗原性強(qiáng),不帶病毒核酸。觀察我國(guó)VLP候選疫苗在小鼠的免疫效果包括體液免疫水平和與細(xì)胞因子水平相關(guān)的細(xì)胞免疫水平,對(duì)后期VLP疫苗的靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)具有重要意義。材料和方法1表達(dá)抗的制備將表達(dá)HIV-1B亞型的gag和gag-V3的重組病毒感染Sf9細(xì)胞,72h收獲上清,上清走8%聚丙酰胺電泳,進(jìn)行Westernblot分析。P55單抗及二抗由NIHAIDSProject贈(zèng)送。陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)PEG8000濃縮后15%蔗糖墊層超離(100,00g,6h,4℃)收集后,PBS稀釋后離心(16000r/min40min4℃)。得到純的gag和gag-V3蛋白,將其溶在20mmol/LTris-HCLpH7.5,150mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA?？乖詸z測(cè)用商用P24試劑盒(VIRONOSTIKAHIV-1ANTIGENKIT)。2小鼠被加佐劑免疫4周齡C57B1/6鼠,在0天、28天以不同劑量(50μg、10μg和1μg)的加佐劑組與無佐劑組分別皮下免疫小鼠,14天后眼眶采血。同時(shí)取脾臟分離淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)在1640液體中,37℃培養(yǎng)4天,收上清。3羊抗鼠igg1和igg2a的表達(dá)用P24抗原(200ng/孔)、gp120抗原(200ng/孔)分別包被96孔板,羊抗鼠IgG1和IgG2a使用滴度為1∶103。常規(guī)ELISA法檢測(cè)IgG1和IgG2a。羊抗鼠IgG1和IgG2a得自德國(guó)UniversityofRegensburg。4病毒釋放量檢測(cè)抗血清56℃30min滅活,按2倍倍比稀釋后,與20TCID50HIV37℃反應(yīng)1h。HIV毒株得自我國(guó)AIDS患者,為B亞型,實(shí)驗(yàn)室傳代1代,保存1年。將病毒血清混合物接種5×104MT4細(xì)胞。37℃CO2潮濕條件下培養(yǎng)6天。用P24試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中病毒釋放量。中和滴度被檢測(cè)。5細(xì)胞因子水平的檢測(cè)ENDOGEN試劑盒檢測(cè)IL-5和IFN-γ水平。此試劑盒由德國(guó)UniversityofRegensburg贈(zèng)送。結(jié)果1gag、gag-vlp抑制劑的純化表達(dá)B、C亞型的gag、gag-V3上清。Westernblot結(jié)果如圖1。gag和gag-V3在gag陽(yáng)性血清為二抗條件下,在分子量55kD處均有一特異性條帶。純化后的gag、gag-V3VLP抗原,PAGE膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示大約75%純度。P24試劑盒檢測(cè)OD值大于3.0。2抗gaggg3個(gè)劑量組的比較表140我們分別對(duì)50μg、10μg和1μg組的gag、gag-V3VLP與佐劑的關(guān)系進(jìn)行觀察。gag免疫鼠血清(1∶40)抗gagIgG3個(gè)劑量組與有無佐劑無關(guān),其差異無顯著性(各組P>0.1)。而gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗gagIgG3個(gè)劑量組與佐劑有關(guān),其差異有顯著性(各組P<0.01)(圖2)。同時(shí)gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗V3IgG3個(gè)劑量組也與佐劑有關(guān),有顯著性差異(各組P=0.01)。3抗3ga、igg2a滴度比較gag和gag-V3VLP(50μg,佐劑)抗血清中,抗gag及抗V3的IgG1、IgG2a滴度均有升高,而IgG2a稍高于IgG1。同時(shí)檢測(cè)了gag和gag-V350μg組抗體的中和能力,gag和gag-V3中和抗體滴度分別為1∶20和1∶40(表1)。4細(xì)胞培養(yǎng)液gag和il-3a表達(dá)的ifn-本實(shí)驗(yàn)對(duì)gag和gag-V3(50μg,佐劑)組產(chǎn)生的兩因子進(jìn)行檢測(cè),小鼠脾淋巴細(xì)胞(gag)產(chǎn)生的IFN-γ為2400pg/ml,IL-5為400pg/ml;gag-V3產(chǎn)生的IFN-γ為1000pg/ml,IL-5為200pg/ml;對(duì)照組IFN-γ是17pg/ml,IL-5是5pg/ml(表2)。免疫原性的確定我們知道Th1細(xì)胞能合成IFN-γ、IL-2、LT,Th2細(xì)胞能合成IL-4、IL-5、IL-6、TL-10和IL-13。Th1和Th2細(xì)胞均能合成TNF-a、IL-3、GM-CSF和分泌巨嗜細(xì)胞炎性蛋白。同時(shí)Th1和Th2細(xì)胞都能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,但輔助的性質(zhì)和強(qiáng)度不同。Th2通過分泌IL-5和IL-4輔助IgG1和IgA的合成;而Th1對(duì)IgG1合成有抑制作用,但輔助IgG2a的合成。我們首次對(duì)中國(guó)流行株HIV-1B亞型gag和gag-V3VLP疫苗的免疫鼠血清中抗體亞型和細(xì)胞因子水平進(jìn)行研究。分析發(fā)現(xiàn)gag和gag-V3免疫鼠血清IgG亞型中IgG1、IgG2a均有不同程度的升高,IgG2a稍高于IgG1。同時(shí)與IgG2a合成相關(guān)的IFN-γ數(shù)量高于與IgG1合成相關(guān)的IL-5。表明gag和gag-V3VLP在鼠體內(nèi)引起Th1/Th2反應(yīng),Th1反應(yīng)稍占優(yōu)勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)道,病毒特異性的Th1反應(yīng)與免疫保護(hù)相關(guān)。gag和gag-V3產(chǎn)生的抗體對(duì)分離于中國(guó)AIDS病人的B亞型毒株有中和作用,與文獻(xiàn)報(bào)道相符。其抗體中和活性不高可能是由于蛋白不恰當(dāng)?shù)恼郫B而致。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,gag和gag-V3VLP疫苗產(chǎn)生抗病毒的中和抗體,而且能引起CD4+T細(xì)胞的應(yīng)答,即Th1和Th2免疫應(yīng)答,Th1免疫應(yīng)答強(qiáng)于Th2免疫應(yīng)答。此結(jié)果為HIV疫苗進(jìn)行靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。在本研究中,我們也對(duì)不同劑量gag和gag-V3與佐劑所產(chǎn)生的IgG1、IgG2a進(jìn)行了檢測(cè),與上述結(jié)果一致。IgG2a升高高于IgG1;gag-V3組IgG1幾乎沒有升高,僅IgG2a升高。這說明gag-V3嵌合蛋白主要產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子的產(chǎn)生也應(yīng)與佐劑相關(guān),但我們對(duì)佐劑和非佐劑組檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生與佐劑的有無并沒有關(guān)系?？赡苁怯捎趯?duì)體外刺激用的抗原滅菌強(qiáng)度過大導(dǎo)致抗原性不強(qiáng)所至。另外,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)gag-V3VLP產(chǎn)生的抗體滴度低于gagVLP抗體滴度(原因不清),同時(shí)gag