高效液相色譜法知識講解課件

高效液相色譜知識講解

第1頁/共49頁1高效液相色譜知識講解

第1頁/共49頁1內容概要工作原理結構組成常見故障與維護HPLC概述HPLC應用第2頁/共49頁2內容概要工作原理結構組成常見故障與維護HPLC概述HPLC應高效液相色譜法(HPLC)是上個世紀七十年代迅速發(fā)展起來的一項高效、快速的分析分離技術，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationphase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。一、HPLC簡介第3頁/共49頁3高效液相色譜法(HPLC)是上個世紀七十年代HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎上發(fā)展起來的，其以液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。其分離機制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細，需高壓泵推動，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調節(jié)，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。第4頁/共49頁4HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎

高效液相色譜法自20世紀60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了對樣品的高速、高效和高靈敏度的分離測定。高效液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗，并引入微處理機技術，極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度?，F(xiàn)在用微處理機控制的高效液相色譜儀，其自動化程度很高，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進樣、洗脫液收集、檢測器功能等)，又能對獲得的色譜圖進行收縮、放大、疊加，以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進行處理等，為色譜分析工作者提供了高效率、功能齊全的分析工具。

第5頁/共49頁5高效液相色譜法自20世紀60年代問世以

高效液相色譜法的應用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質的特點而被廣泛應用于生物化學、藥物及臨床分析，世界各國己將該法收載于藥典。第6頁/共49頁6高效液相色譜法的應用范圍十分廣泛，液相色譜檢測器UV–VISFLDDAD

ELSDECDRID

液相色譜檢測器火焰離子化檢測器、手性、化學發(fā)光、核磁共振、質譜檢測器等新型檢測技術第7頁/共46頁第7頁/共49頁7液相色譜檢測器UV–VISFLDDADELSDECDRIDHPLC的特點GC與LC的比較測定對象拓展檢測器不同第8頁/共49頁8HPLC的特點GC與LC的比較測定對象拓展檢測器不同第8頁/由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點限制，因此具有更廣闊的應用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展，高效液相色譜法在基礎理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學化工、環(huán)境、藥學、食品等多個領域中最具優(yōu)勢的分離分析方法之一。第9頁/共49頁9由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點第二節(jié)基本原理液相色譜根據(jù)分離機理的不同可分為：

液固吸附色譜

液液分配色譜離子交換色譜離子對色譜法

分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)第10頁/共49頁10第二節(jié)基本原理液相色譜根據(jù)分離機理的不同可分為：第10（一）液-固吸附色譜

流動相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質吸附作用的不同來分離物質。第11頁/共49頁11（一）液-固吸附色譜流動相為液體，固定相為固體吸附劑

流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進行分離。一種液相為流動相，另一種是涂于載體上的固定相。流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。（二）液-液分配色譜第12頁/共49頁12流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜（三）離子交換色譜（四）離子對色譜法（五）分子排阻色譜法第13頁/共49頁13（三）離子交換色譜（四）離子對色譜法（五）分子排阻色譜法第11100/1200HPLC儀器的結構組成：在線脫氣機(G1322A,G1379A/B)二元/四元泵(G1310A,G1311A,G1312A/B)自動進樣器(G1313A,G1329A/B,G1367A/B/C/D)柱溫箱(G1316A/B)二極管陣列檢測器(G1315A/B/C/D)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、HPLC結構組成第14頁/共49頁141100/1200HPLC儀器的結構組成：三、HPLC結構HPLC

系統(tǒng)溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵樣品引入系統(tǒng)：進樣器樣品分離系統(tǒng)：關鍵色譜柱信號檢測系統(tǒng)：檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：軟件第15頁/共49頁15HPLC

系統(tǒng)溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵樣品引入系統(tǒng)：進樣器樣泵的基本原理往復活塞泵(單向閥)彈簧隔板/紅寶石球串聯(lián)柱塞泵消除流量脈沖

并聯(lián)柱塞泵減小流量脈沖

第16頁/共49頁16泵的基本原理往復活塞泵(單向閥)彈簧隔板/紅寶石球串聯(lián)柱塞泵儀器：四元泵不是４個泵／必配真空脫氣機／二元泵各控制一種溶劑四元泵ＭＧＧＶ在起作用ＭＧＧＶ：比例閥

ＡＩＶ：主動閥

ＯＢＶ：單向閥第17頁/共49頁17儀器：四元泵不是４個泵／必配真空脫氣機／二元泵各控制一種溶劑儀器：手動進樣器-六通閥/定量環(huán)六通閥定量環(huán)LoadInject通廢液口進柱定量環(huán)第18頁/共49頁18儀器：手動進樣器-六通閥/定量環(huán)六通閥定量環(huán)LoadInje儀器：自動進樣器自動進樣100樣品盤/機器手/自動洗針機械手樣品盤第19頁/共49頁19儀器：自動進樣器自動進樣100樣品盤/機器手/自動洗針機械手色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架柱溫箱外掛架第20頁/共49頁20色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架柱溫箱外掛架第20頁/共49頁2儀器：檢測器-紫外UV/Vis雙燈，全波長檢測ＤＡＤ檢測器流路第21頁/共49頁21儀器：檢測器-紫外UV/Vis雙燈，全波長檢測ＤＡＤ檢測器流儀器：化學工作站進樣器高壓泵流動相色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理第22頁/共49頁22儀器：化學工作站進樣器高壓泵流動相色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理第22固定相與流動相反相HPLC

極性:固定相<流動相固定相-極性弱流動相(甲醇,乙腈等)-極性強極性小物質后出峰正相HPLC 極性:固定相>流動相固定相-極性強流動相(己烷,庚烷)-極性弱極性物質后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%與固定相

極性相近

tR長主流第23頁/共49頁23固定相與流動相反相HPLC正相HPLC 正流動相(反相)常用溶劑：乙腈、甲醇、水等實際使用：甲醇-水/乙腈-水混合體系等度洗脫：流動相比例恒定

梯度洗脫：逐步提高有機溶劑比例第24頁/共49頁24流動相(反相)常用溶劑：乙腈、甲醇、水等實際使用：甲醇-水/流動相就比如人體的血液，其質量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與否。

應該使用HPLC級的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換！一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑。

注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的最低波長,低于該波長后,溶劑會有很強的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質的檢測。四、HPLC常見故障與維護1、HPLC對流動相的一般要求第25頁/共49頁25流動相就比如人體的血液，其質量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與

HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時，必須把使用水的管路用有機溶劑置換，防止長霉。

儀器使用完后要采用適當?shù)娜軇_洗等方法維護色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

儀器長期不用時，不建議使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

當有流路堵塞時，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH4至7)中尤其如此。第26頁/共49頁26HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾

檢查溶劑過濾器

查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，此時溶劑會因為重力流出。當脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出–臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

清潔溶劑過濾器

將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35％左右)的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（可以高溫滅菌），每三個月至少清洗一次第27頁/共49頁過濾器27檢查溶劑過濾器第27頁/共49頁過濾器27

將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上，有機溶劑通道最好在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結晶。操作泵之前，用至少兩個體積（標準脫氣機30mL，對微脫氣機10mL）沖洗真空脫氣機,特別是當泵關閉了一段時間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時，防止溶劑瓶內的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌，當濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞，應立即清洗或更換。定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動相。-對于標準脫氣機(G1322A),流速5ml/min水，若壓力大于10bar，則建議更換。-對于微量脫氣機(G1379A),流速2ml/min水，若壓力大于5bar，則建議更換第28頁/共49頁泵的使用要點28將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當在四元泵上使用鹽

當使用低流速時，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測試或漏液測試。每當更換泵密封墊時排液閥慮芯也應更換。更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應盡早更換有劃痕的活塞。使用緩沖溶液時，關泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當需要長時間使用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時，最好選用密封墊清洗附件，以減少對密封墊及活塞桿的磨損。如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以考慮用熱水（50－60℃）來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。更換活塞密封墊后應按照密封墊安裝步驟對其進行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。第29頁/共49頁29當使用低流速時，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測

當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調至約2－3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對于二元泵SL，如果不使用鹽溶液可以不開)10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。當泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10％異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外)，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要，可以改變壓縮因子（compressibility）來達到更好的效果。第30頁/共49頁30當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就下列建議將會延長溶劑過濾器的使用壽命并維持泵的運行。使用新鮮配制的流動相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議每天更換。避免溶劑瓶暴露在直射陽光下（尤其對于水、THF等）用氬氣置換流動相上層的空氣如果應用許可，在溶劑中加人0.0001－0.001M的疊氮化鈉(不適用于LC/MS)如果允許，可以考慮永遠在水相中加入5%或以上濃度的有機溶劑(甲醇、乙腈)。有時因為有氣泡吸附在管壁上而造成氣泡難以排出時，可以提起管線，使吸入一個大氣泡。讓大氣泡把吸附在管壁上的小氣泡一起帶走。如果在purge時發(fā)現(xiàn)從purge閥一直有氣泡流出。這時應考慮并非泵里面仍有氣泡，而是液體從一個內徑較細的管路(Purge閥出口內徑比較細)流入一個內徑較粗的管線(廢液管的內徑要粗很多)所引起。第31頁/共49頁31下列建議將會延長溶劑過濾器的使用壽命并維持泵的運行。第31頁泵的主要日常維護項目：更換PurgeValve的PTFE過濾芯（Frit）清洗,更換主動閥閥芯清洗出口單向球閥更換柱塞桿或者柱塞桿密封圈第32頁/共49頁32泵的主要日常維護項目：第32頁/共49頁32自動進樣器樣品在進樣前必須經(jīng)過適當?shù)念A先處理，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，最好使用流動相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應該對樣品有較好的溶解性。針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時空氣中的較大灰塵顆?？赡芮『寐湓卺樧牧髀穬榷疳樧亩氯?。這時候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。如果經(jīng)常使用緩沖溶液，除了泵頭之外，ALS計量泵的柱塞及密封圈，六通閥的轉子密封圈和定子密封圈應該定期清洗，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋；使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。第33頁/共49頁33自動進樣器樣品在進樣前必須經(jīng)過適當?shù)念A先處理，需要經(jīng)過亞微米漏液－針座磨損，堵塞－轉子磨損進樣量不準―轉子磨損―計量泵故障―抽樣速度太快，樣品粘度太―進樣閥的4＃廢液口堵塞**機械臂移動故障-抓不準樣品瓶－傳感器故障－周圍環(huán)境差－樣品瓶不標準初始化失?。璏otorTemp－馬達故障－傳感器故障－周圍環(huán)境差第34頁/共49頁自動進樣器常見故障34漏液第34頁/共49頁自動進樣器常見故障34自動進樣器日常維護

定期檢查各傳動桿是否足夠潤滑，必要時先用酒精棉球擦拭干凈后再給這些桿涂抹少量液潤滑油，臟的傳動桿使阻力增大從而造成自動進樣器在取樣過程中由于馬達過熱導致出錯。檢查取樣爪子的綠色膠套時否損壞，如果損壞請更換之，否則會使樣品放置位置不正確而導致針或針座等的損壞。(僅對于標準自動進樣器)用酒精棉簽擦拭針座防止灰塵污染堵塞針與針座。必要時可以拆下超聲清洗。第35頁/共49頁35自動進樣器日常維護第35頁/共49頁35UV燈不能點亮－燈壞了需要更換（一般是這個故障）－主板或電源有問題基線不穩(wěn)－流通池臟了－環(huán)境溫度不穩(wěn)定造成的基線波動－柱子臟了或沒有平衡－泵壓力不穩(wěn)造成的基線波動－D2能量低或不穩(wěn)定－出口廢液管太短造成流通池壓力不穩(wěn)引起的基線問題第36頁/共49頁DAD常見故障及原因36UV燈不能點亮第36頁/共49頁DAD常見故障及原因36HPLC日常維護－總結1清洗使用過緩沖鹽的色譜柱時最好不要使用100％的水，因為大部分C18柱并不適合純水的流動相。使用磷酸鹽緩沖溶液，盡量避免和乙腈同時使用，因為磷酸鹽在乙腈內溶解度很小。如果一定要使用的話，建議預先手動混合而非在線自動混合。注意不同檢測器的出口廢液管。因為Agilent設計的廢液管同時有穩(wěn)定流通池壓力的阻尼作用。所以，廢液管不能太短，否則可能引起流通池內壓力不穩(wěn)而造成基線波動。同時，注意保持廢液管的暢通，因為不同流通池耐壓不同，VWD40bar，DAD120barMWD120barFLD20barRID5bar(RID、FLD永遠只能是最后一個檢測器)，堵塞的廢液管可能造成流通池過壓而破裂2、HPLC日常維護第37頁/共49頁37HPLC日常維護－總結12、HPLC日常維護第37頁/共49

HPLC日常維護－總結2定期清洗溶劑過濾頭(35％濃硝酸浸泡1小時，不建議使用超聲波清洗)，流動相應經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾，如果使用濾膜，注意有機膜與水膜的區(qū)別。根據(jù)情況更換Purge閥內的在線過濾頭（Purge閥打開，純水5ml/min，壓力超過10bar時需更換）。注意清洗在線脫氣機及比例閥，尤其是長期使用水相或緩沖鹽的通路，使用純水沖洗后，再使用甲醇沖洗，可以打開Purge閥，使用5ml/min的流速。第38頁/共49頁38HPLC日常維護－總結2第38頁/共49頁38HPLC日常維護－總結3安裝有sealwash組件的，無論是否使用緩沖鹽，開泵之前都應該使之充滿流動的液體（10%IPA水溶液）并調流速為2－3滴/分鐘。如果安裝有自動SealWash，則可以通過軟件自動控制。正相色譜、反相色譜切換時應使用IPA過渡，長期使用正相（正己烷等完全非極性溶劑），應更換正相柱塞密封墊。樣品進樣之前最好過濾，如果樣品量太少，可以適當抬高進樣針的位置流動相pH長期大于9.5或小于2.3時，進樣閥應更換tefzel轉子密封圈。注意不同檢測器流通池耐壓問題，盡量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞。第39頁/共49頁39HPLC日常維護－總結3第39頁/共49頁1100/1200HPLC故障診斷幾個基本規(guī)則重現(xiàn)性：如果問題不重復出現(xiàn)，很難證實其確實存在，也很難診斷問題。唯一性：在排除故障的過程中一次只變化一個因素，以使你能夠確認所變因素與問題之間的關聯(lián)?；謴驮瓲睿喝绻褂酶鼡Q組件方法來查找問題根源，則完畢后應將原有原來完好組件安裝回原處；否則,換下的組件將來很難再利用,也可能造成誤判。預見性：利用成功的故障排除經(jīng)驗來改善您目前的預防保養(yǎng)工作,使現(xiàn)有問題再發(fā)率降至最低。良好的記錄習慣：一個好記錄是成功地進行故障排除的關鍵。比如軟件出了錯誤提示而關閉，那么最好的辦法就是把屏幕copy下來以供診斷使用第40頁/共49頁3、HPLC常見故障診斷401100/1200HPLC故障診斷幾個基本規(guī)則第40頁/共HPLC故障診斷1-系統(tǒng)壓力過高首先擰開排液閥，以純水作流動相并設流速為5ml/min若壓力超過10bar，應先更換排液閥的慮芯。若排液閥的慮芯沒有堵塞，卸下色譜柱，然后用一個兩通代替色譜柱，以水作流動相設流速為1ml/min。通常壓力不會超過20bar,否則系統(tǒng)可能有堵塞。若上述的壓力超過20bar,我們可按照從后到前的原則，依次拆下各條連接毛細管，最后就可以找到堵塞的地方。容易堵塞的地方：流動池入口管；自動進樣器的針及針座；柱溫箱加熱塊。第41頁/共49頁41HPLC故障診斷1-系統(tǒng)壓力過高第41頁/共49頁41HPLC故障診斷2-系統(tǒng)壓力過低首先擰開排液閥，設流速1~2ml/min后開泵，觀察有無液流；若有再仔細觀察液流是否有倒吸現(xiàn)象。如不能確定可用量筒測量流速的準確性。上述無液流，或流速不準多數(shù)為主動閥閥芯或主動閥故障，或泵有嚴重漏液?？梢詫⒅鲃娱y閥芯取出進行超聲波清洗，也可以進一步嘗試拆下出口球閥超聲清洗。如仍有問題，可考慮更換閥芯。注意，千萬不要把整個主動閥放入超聲波清洗這樣會損壞主動閥。若上述流速準確但擰緊排液閥后壓力不穩(wěn)定，請仔細檢查有無漏液。通常漏液地方：各接口包括色譜柱，泵，進樣閥等。第42頁/共49頁42HPLC故障診斷2-系統(tǒng)壓力過低第42頁/共49頁42HPLC故障診斷3-保留時間不穩(wěn)定首先觀察保留時間是否有規(guī)律的變化，并同時觀察壓力是否穩(wěn)定。若壓力穩(wěn)定而保留時間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有鹽的流動相，需較長的時間去平衡。若壓力穩(wěn)定而保留時間無規(guī)律變化，應檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時間，