釀酒酵母saccharomcene線粒體內(nèi)nadh氧化機制的研究進展

釀酒酵母saccharomcene線粒體內(nèi)nadh氧化機制的研究進展

發(fā)酵培養(yǎng)基缺乏活性物質(zhì)的運作酶活力。nad-h和nad-h氧化還原未通過汗膜。因此,要保持胞內(nèi)的氧化還原平衡,還原性的輔酶必須在相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)再次氧化。與NADPH轉(zhuǎn)運不同(主要發(fā)生在胞質(zhì)中),NADH轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在有氧和無氧條件下,都是胞內(nèi)和線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運所必需的。無氧代謝條件下,酵母氧化NADH的唯一途徑是通過甘油的產(chǎn)生,而在有氧條件下,則存在好幾個系統(tǒng)將胞內(nèi)的NADH轉(zhuǎn)運到線粒體電子傳遞鏈,其中最重要的是外源NADH脫氫酶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(Nde1p/Nde2p)和三磷酸甘油穿梭脫氫酶系。Nde1p/Nde2p位于線粒體內(nèi)膜,擁有催化位點且伸向內(nèi)膜空間,對胞內(nèi)NADH起直接的氧化作用。三磷酸甘油穿梭系統(tǒng),包括Gut2p和輔因子Gpd1p,同樣對維持胞質(zhì)內(nèi)氧化還原平衡有重要作用,但需要借助呼吸鏈來完成。這兩個系統(tǒng)在一定條件下能夠相互補充,卻不足以在胞質(zhì)內(nèi)NADH的代謝調(diào)控中彼此完全取代,而是存在一些復(fù)雜有序的代謝過程。目前對此一致的認為是:①5個面向內(nèi)膜空間的脫氫酶系(Nde1p、Nde2p、Gut2p、Dla1p和Cyb2p)組成一個復(fù)合體,通過酶與酶之間的緊密接觸,形成一個影響底物與產(chǎn)物的渠道;②外源的NADH脫氫酶對三磷酸甘油脫氫酶有抑制作用;③使用滲透性原生質(zhì)體,代謝物通過膜孔蛋白受阻,且成為影響呼吸率的關(guān)鍵控制點。另外,促使胞質(zhì)內(nèi)NADH產(chǎn)生的酶與線粒體內(nèi)的NADH脫氫酶建立了某一通道,而這一通道的實現(xiàn)是由包括膜孔蛋白在內(nèi)的各代謝網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)的。這些都說明酵母菌胞內(nèi)NADH代謝是受高度組織和調(diào)控的。1磷酸甘油穿透系統(tǒng)有氧條件下的酵母生長,維持胞內(nèi)氧化還原平衡的最主要機制是NADH脫氫酶和三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)。但是在不同條件下,這兩種系統(tǒng)的相對重要性有所側(cè)重。葡萄糖濃度高的情況下,三磷酸甘油穿梭活性受阻,原因是該系統(tǒng)中一個成分Gut2p易受葡萄糖濃度的抑制。相比之下,低葡萄糖濃度下如恒化培養(yǎng),胞外NADH脫氫酶和三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)幾乎同時起作用,不過脫氫酶顯得更加重要,原因是突變引起的Nde1p/Nde2p缺失比Gut2p突變?nèi)笔Ц鼮槊黠@。與低稀釋率的葡萄糖限制性恒化培養(yǎng)相比,這兩個系統(tǒng)同時作用是為了保證更多的NADH的產(chǎn)生。當稀釋率達到一定的強度時,胞外NADH脫氫酶和三磷酸甘油穿梭中產(chǎn)NADH的能力都減少了,其中尤以三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)中減少更多。另一個顯著的現(xiàn)象是,不僅Ndep和Gut2p對ATP的抑制敏感,Gpd1p對ATP也異常敏感。即使在非常低的ATP濃度下,如1mmol/L,體外分析證實了它有50~80%的活力被抑制了。而對于正處于生長期的酵母來說,更易受低水平ATP的抑制,但目前并未搞清這種抑制的機理何在。不少學者曾指出,三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)真正起作用是呈現(xiàn)在低生長率的情況下,甚至是饑餓狀態(tài)。例如,在乙醇限制性恒化培養(yǎng)中,當稀釋率從0.09下降到0.05h-1時,三磷酸甘油脫氫酶穿梭能力逐漸增強。相似的是,一個突變?nèi)毕菪途闚de1p和Nde2p,在葡萄糖限制的恒化培養(yǎng)中,低稀釋率情況下表現(xiàn)出好氧呼吸性生長,而在高稀釋率情形下則開始厭氧產(chǎn)生乙醇。這表明低流量NADH形成時,三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)對維持胞內(nèi)的氧化還原平衡是足夠的,而NADH濃度高于某一特定值時,胞外NADH脫氫酶活性就變得非常必需,它的作用就在于避免了乙醇的積累。出現(xiàn)這種情形的原因也許是在饑餓狀態(tài)下,三磷酸甘油穿梭系統(tǒng)的作用可能更為關(guān)鍵,因為它與胞外的NADH脫氫酶相比,有更高的ATP/O比。也就是說,在可利用的能量有限的情況下,三磷酸甘油穿梭更為有效。而胞外的NADH脫氫酶在能量充足的情況下更為優(yōu)越,因而更適合于高能荷狀態(tài)。BakkerBM,etal.認為當三磷酸甘油作為底物時比NADH作底物時的ATP/O能荷比要高。在這里我們有必要指出其中很重要的一點,即這些作者在得出這一結(jié)論時,也許忽略了氧化磷酸化(ATP/O)和呼吸控制率(RCR)之間的關(guān)系,因而在解釋NADH為底物時,只看到了乙醇對可利用的NADH的抑制作用,使得ATP/O的比值低。然而這一說法并不能完全支持他們的觀點,因為在乙醇作為底物時,有更高的ATP/O率,這是一個不爭的事實。而且當使用NADH再生系統(tǒng)(在這一系統(tǒng)中NADH不受乙醇的毒害),AveretN,etal.測試到在使用NADH為底物時,ATP/O的比還是很低。ATP/O率的高低依賴于代謝流量(代謝流量高,ATP/O率越低)。同時AveretN也指出,對于這樣一項研究,分離線粒體并不是一種最好的模式;RCR在氧化磷酸化的過程中,亦不是一個理想的指示劑,因為當代謝流受控于上游呼吸鏈時,RCR很低,而ATP/O很高。因此,未來的研究也許需要從研究手法上加以改進。2線條和核心成分對氧化磷酸化的影響2.1滲透型原生質(zhì)體的能量線粒體內(nèi)的氧化磷酸化是一項高度復(fù)雜有序的控制網(wǎng)絡(luò)。在這一網(wǎng)絡(luò)中,ATP必須連續(xù)適應(yīng)細胞內(nèi)能量的變化以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常生長。除了分離的線粒體中所描述的調(diào)節(jié)機制外,另外兩個機制必須考慮進來。一是在酵母菌的完全呼吸生長中,線粒體內(nèi)的調(diào)節(jié)涉及到一個長期的氧化磷酸化過程。更特殊的是,呼吸受質(zhì)子滲漏和質(zhì)子泵入的驅(qū)動,這是整個有氧代謝中最主要的擴散途徑。當菌體由于生長需要,ATP轉(zhuǎn)運減少時,線粒體成分亦減少,因而菌體將能量用于生長并保持一個連續(xù)的焓生長率。而且在此過程中,至少是部分依賴于Ras/cAMP/PKA級聯(lián)信號途徑的。例如,菌體在連續(xù)高活力的Ras/cAMP/PKA下,在乳酸上級聯(lián)生長,每個細胞有更多的線粒體。因此,這些菌體表現(xiàn)出高的呼吸率,而且他們的焓生長率比野生菌株的要低。二是線粒體在細胞內(nèi)并不是隨意分布,而是呈現(xiàn)高度有機統(tǒng)一的網(wǎng)絡(luò)分布狀態(tài),用以優(yōu)化細胞內(nèi)能量平衡。這一事實可以說明在分離的線粒體和體內(nèi)研究線粒體時,所呈現(xiàn)出的量的不均一性。它使我們可以看到細胞內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu)分布在他們的體外功能上扮演重要角色,例如,為了分析細胞結(jié)構(gòu)整合到線粒體代謝的相關(guān)性,AveretN,etal.在酵母細胞中使用一個滲透研究模型,用以同體外分離的線粒體進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),滲透型原生質(zhì)體、線粒體與分離的線粒體有兩個主要的不同:①乙醇代謝主要發(fā)生在胞內(nèi),主要通過乙醇脫氫酶和線粒體外的NADH脫氫酶系來完成;②在體內(nèi),線粒體在丙酮酸上有一個高的呼吸率,而在分離的線粒體中沒有觀察到高的呼吸率,原因是丙酮酸在分離的過程中已經(jīng)消失了。2.2分離型平均編碼量胞質(zhì)成分的調(diào)控中以丙酮酸為主。丙酮酸脫羧酶(一種胞液酶),是不依賴于蘋果酸的丙酮氧化所必需的。中間缺失型基因PDA1,由丙酮酸脫羧酶的E1亞基編碼,沒有影響原生質(zhì)體的呼吸率,但是降低了依賴蘋果酸的分離型線粒體的呼吸。突變中斷了線粒體上乙醛基因ALD4,不能氧化丙酮酸,除非有蘋果酸的加入。因此,AveretN,etal.認為在線粒體上存在一種與胞質(zhì)中丙酮酸脫氫酶來源不同的另一通道,在這里丙酮酸脫羧生成乙醛,并被線粒體上的乙醛脫氫酶所氧化。3氨基乙烯基瓜氨酸對nadh的重要性3.1呼吸鏈及透照厚度por1p的研究在許多滲透細胞中,線粒體上通過膜孔蛋白的封閉限制ADP的擴散從而調(diào)節(jié)呼吸率。在滲透細胞中測得的表觀呼吸率與分離的線粒體相比,其呼吸率要高約20倍。而且,滲透型細胞的外層線粒體膜的擴散,其ADP的擴散與分離的線粒體的觀察值基本相似。AveretN,etal.通過實驗觀察到了在滲透性的釀酒酵母中有同樣的現(xiàn)象,且發(fā)現(xiàn)有如下特點:①代謝擴散受限是普遍存在的,并且這種抑制強度與分子量和離子狀態(tài)有關(guān),對于高分子量的物質(zhì)來說,如NADH,擴散抑制特別的高;②膜孔蛋白缺陷型突變Por1p,對NADH的呼吸效率在分離的線粒體和通透性的原生質(zhì)體間的差異不存在了。因此可以說,在分離的線粒體中,膜孔蛋白總是開放,而在通透性原生質(zhì)體上則總是封閉。另外,在體內(nèi)測得的NADH濃度為0.2mmol/L,即位于以NADH為底物測得的分離型線粒體的值(0.05mmol/L)和滲透性原生質(zhì)體下的值(0.7mmol/L)之間。因此在某種意義上說,膜孔蛋白的生理狀態(tài)(開放或封閉)是通過呼吸鏈來使胞質(zhì)內(nèi)NADH再次氧化的主要決定因素。另外,學者們通過滲透性原生質(zhì)體胞質(zhì)研究NADH的分派,通過胞內(nèi)依賴NAD+的脫氫酶系(如三磷酸甘油脫氫酶或乙醇脫氫酶)直接生成NADH。發(fā)現(xiàn)通過這些酶產(chǎn)生NADH時,呼吸鏈通往NADH的效率增強,且與分離的線粒體上增補NADH的效率相同。此外,在對NADH的效率上,膜孔蛋白缺失菌株未能顯示任何差異,不論這種NADH是外加的還是胞內(nèi)自身生成的,因而進一步的證實效率的增加與膜孔蛋白的開放狀態(tài)密切相關(guān)。3.2膜孔蛋白開放、關(guān)閉與布署內(nèi)脫氫酶活性呼吸鏈對外加NADH的效率并沒有因其它酶的活性增加而提高,例如,依賴NADP+的6-磷酸葡萄糖脫氫酶或激酶,所觀察到的效率增加并不是因為胞內(nèi)脫氫酶系活力的改變?？偟膩砜?胞內(nèi)依賴型NAD+脫氫酶膜孔蛋白通道的開啟,允許NADH更好地向線粒體釋放。也就是說,當膜孔蛋白關(guān)閉時測得的NADH呼吸效率很低,因為這個區(qū)域的NADH濃度接近外層NADH脫氫酶濃度,而這一濃度比整個細胞的平均NADH濃度要低。相比之下,當膜孔蛋白開放時所測的NADH濃度實際上與內(nèi)膜空間的濃度相當,因為擴散不再受限制。這一點或許非常重要,因為目前的數(shù)據(jù)還沒有提供一個反映呼吸鏈到NADH本質(zhì)改變的數(shù)據(jù)或結(jié)果。但從已有的結(jié)果來看,在一定條件下膜孔蛋白增加了呼吸鏈上NADH氧化磷酸化的效率。不過,當NAD+依賴型胞內(nèi)脫氫酶活性很高時,ADP的擴散沒有增加,目前還不能解釋所觀察的結(jié)果通過簡單的膜孔蛋白開放與關(guān)閉機制。大部分的文獻趨同這樣一種認識,即NADH是經(jīng)膜孔蛋白開辟的一條通路,并且這種代謝網(wǎng)絡(luò)受胞內(nèi)脫氫酶的活性所調(diào)節(jié)。這種渠道機制能夠?qū)⒔?jīng)NADH直接轉(zhuǎn)運到線粒體外膜內(nèi)側(cè)的NADH脫氫酶。這個過程符合生理重要性,即線粒體上己糖激酶能將產(chǎn)生的ADP有效的帶回到氧化磷酸化過程當中,增強NADH的再氧化。4面向宣傳的nadh脫氫酶大多數(shù)時候我們都認為線粒體矩陣的高蛋白濃度抑制了代謝物的擴散,因而各種酶之間的通道需要克服擴散障礙。但是也有作者證實位于線粒體矩陣上的GFP能夠順利擴散,表明其它的矩陣蛋白在線粒體膜上形成了包膜復(fù)合物,這種復(fù)合物的形成構(gòu)成了一個相對疏水的環(huán)境,從而使代謝產(chǎn)物順利擴散。這些表明,即使不完全明了線粒體上各種酶的復(fù)合物在代謝通路上扮演了何種角色,也能肯定各種酶在線粒體膜上以某種方式形成了超分子復(fù)合物。不少動力學數(shù)據(jù)表明,線粒體中各種酶之間的相互通道的建立與NADH的代謝有關(guān)。這主要體現(xiàn)在蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶之間的相互通道的存在以及蘋果酸合酶與順烏頭酸酶之間相互的通路存在。它們都與NADH的代謝有關(guān)。非變性電泳和變性電泳法常用于分析線粒體上的酶復(fù)合物,這在分析哺乳動物線粒體以及呼吸鏈化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ上常用。分析酵母線粒體時,通過同化和異化變性電泳,再經(jīng)分析呼吸鏈上各復(fù)合物的關(guān)聯(lián),而后輔以活性測定,表明存在一個高分子量的復(fù)合物以體現(xiàn)NADH脫氫酶的活性。有趣的是,這一復(fù)合體也體現(xiàn)了三磷酸甘油脫氫酶的活性,表明這些酶之間存在某種關(guān)聯(lián)性。在突變型菌株缺失NDE1和NDE2的酵母中,該復(fù)合體的NADH脫氫酶活性便不復(fù)存在,說明這種酶活力直接與面向線粒體的NADH脫氫酶的有無相關(guān)。這種復(fù)合物的組成與成分包括5種面向內(nèi)膜的脫氫酶系,即2種NADH脫氫酶Nde1p和Nde2p、三磷酸甘油脫氫酶Gut2p以及兩種乳酸脫氫酶Dld1p和Cyb2p。另外復(fù)合體還包括面向線粒體矩陣的NADH脫氫酶Ndi1p、三羧酸循環(huán)中的5種酶(琥珀酸脫氫酶Sdh1p、延胡索酸酶Fum1p、蘋果酸脫氫酶Mdh1p、檸檬酸合酶Cit1p以及異檸檬酸脫氫酶Idh2p)、乙醛脫氫酶Ald4p以及兩種新的丙酮酸脫氫酶,分別由ORFs和YOR004C編碼。這種超復(fù)合物不是一種剛性結(jié)構(gòu),例如在無義突變gut2基因的菌株中該復(fù)合體依然存在。同時在無義突變Ald4菌株中存在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體Pda1p和Lpd1p兩個亞基,而這兩個亞基在野生型菌株中并不存在。這表明當Ald4p不存在時,起主要作用的NADH產(chǎn)生型酶Ald4p亞基與NADH脫氫酶復(fù)合體的關(guān)聯(lián),能夠被次要的NADH產(chǎn)生途徑和復(fù)合體的結(jié)合所取代。這種酶與復(fù)合體的關(guān)聯(lián)也許是一定條件下線粒體代謝調(diào)控的一種方式。5外源nadh脫氫酶的活性上述提到的面向內(nèi)膜空間的5種脫氫酶形成一個超復(fù)合分子,使得各種酶之間有更為緊密的相互接觸,從而開啟了一條影響底物與產(chǎn)物的通路。而且這一現(xiàn)象也可能從另外一個全新的角度來解釋調(diào)控機制。應(yīng)用從野生型菌株中分離的線粒體和各種突變株(GPD1△、GUT2△、GPD1△GUT2△、NDE1△/NDE2△),發(fā)現(xiàn)除上述基因使得一種外源脫氫酶活力的喪失(如NADH脫氫酶或者三磷酸甘油脫氫酶)外,卻增強了保存性酶與底物的親和力,從而增強了酶的催化效能。這種在缺乏選擇性脫氫酶時,與底物親和力的增加也許是因為增加了酶與底物靠近的機會。在這一點上,有學者觀察到了另外一個類似的結(jié)果,即在酵母菌的恒化培養(yǎng)中外源NADH脫氫酶對NAD