大腸桿菌藍藻調(diào)節(jié)二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6磷酸的基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建

大腸桿菌藍藻調(diào)節(jié)二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6磷酸的基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建

由于溫室氣體濃度的增加，世界溫度變化和氣候變化引起了廣泛的關(guān)注，其中二氧化碳是溫室的主要氣體。按照政府間氣候變化專業(yè)委員會(IPCC)的分析,若按照目前CO2排放的趨勢增長,到下個世紀,全球平均溫度將以每10年0.2～0.4℃的速度升高,從而帶來氣候變暖、海平面升高、耕地減少、農(nóng)業(yè)病蟲害加劇、北極圈CO2生態(tài)失衡等一系列惡果。光合作用是地球上最大規(guī)模地將光能轉(zhuǎn)化為化學能的化學反應,是地球上生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。藻類是光合固定CO2的主要生物之一,因此采用代謝工程將光合效率較高的高等植物中與固定CO2密切相關(guān)的幾個關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入藍藻等光合細菌中,提高其固定CO2效率,使之能在較高濃度CO2條件下通過強化的光合作用合成較多的生物物質(zhì);若引入其他利用這些生物物質(zhì)的途徑,如將外源的聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHAs,一種生物可降解塑料的原料)生物合成途徑引入該藍藻,可以改變其代謝流,使通過光合固定CO2合成的生物物質(zhì)流向產(chǎn)生PHAs的代謝途徑。這樣形成的轉(zhuǎn)基因藍藻有可能既吸收發(fā)電廠等排出的大量CO2,同時又生產(chǎn)生物可降解塑料的原料PHAs。光合生物固定CO2的限速步主要集中在暗反應,而其中的Calvin循環(huán)(也稱C3循環(huán))是所有光合生物碳素光合流動過程的中心環(huán)節(jié)。在Calvin循環(huán)中從核酮糖二磷酸吸收CO2到合成果糖-6-磷酸要經(jīng)過6個酶的連續(xù)催化,即:(1)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco);(2)磷酸甘油酸激酶(PGK);(3)磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH);(4)丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI);(5)果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(ALD);(6)果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)。該循環(huán)中有兩個主要的分支點:第一個分支點位于三碳糖-二羥丙酮磷酸(DHAP)的位置上。在這里,DHAP能夠很快地透過葉綠體的包膜進入細胞質(zhì),并在其中逐步轉(zhuǎn)化成蔗糖。涉及該分支點的酶是ALD和TPI,且ALD又是固定CO2后第一個催化3C化合物轉(zhuǎn)化為6C化合物的酶,同時也是控制光合作用速率的重要酶之一。最近Monsanto公司的研究人員利用此原理在轉(zhuǎn)基因植物中大量表達大腸桿菌的ald基因,使得植物生成淀粉和蔗糖的能力有所提高,從而提高作物產(chǎn)量。第二個分支點位于6-磷酸果糖的位置上,由此源源不斷在葉綠體內(nèi)合成淀粉。涉及該分支點的酶是FBPase,也是控制光合作用的重要酶,同時還是調(diào)控Calvin循環(huán)中PO3-4循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,該酶催化的反應是不可逆的。因此,構(gòu)建TPI-ALD-FBPase的3個基因共表達體系并轉(zhuǎn)入光合菌對于提高宿主細胞固定CO2的效率極有可能產(chǎn)生某些有利的影響。在本實驗室以往工作的基礎(chǔ)上,本文報道編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶和果糖-1,6-二磷酸酶的3個基因共表達體系的構(gòu)建、表達及功能測定,并構(gòu)建了共表達的大腸桿菌-藍藻穿梭表達質(zhì)粒,完成了在大腸桿菌中的活性共表達。之所以選擇這3個反應作為突破口,除上述考慮外,更由于它們是Calvin循環(huán)中最單純的部分,不涉及能量分子ATP的合成,又沒有要求其他輔助因子(如NADPH)的參與等復雜因素。1材料表面1.1其他生化試劑和分析方法寡核苷酸片段GATCTTTT(a)和AATTAAAA(b)按亞磷酰胺三酯法在DNA合成儀上合成純化;NADP+、IPTG和果糖-1,6-二磷酸(FDP)購自伯奧生物技術(shù)公司;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)化酶(PGI)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶、考馬斯亮藍R-250、對甲基苯磺酰氟(PMSF)、Dowex-1型陰離子交換樹脂、Dowex50×8H+型離子交換樹脂購自Sigma公司;各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、多核苷酸磷酸化酶、NADH、NAD+、哌嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸)(Pipes)、蛋白質(zhì)分子量標準(proteinmolecularweightmarkers)購自華美生物工程公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)購自BoehringerMannheim公司;蛋白質(zhì)定量Bradford試劑購自Bio-Rad公司;β-巰基乙醇購自Fluka公司;其他無機鹽和常用化學試劑為國產(chǎn)分析純試劑。磷酸二羥丙酮(DHAP)是以二羥基丙酮為原料經(jīng)POCl3磷酸化成鋇鹽,經(jīng)Dowex50×8(H+)離子交換柱處理得到DHAP,平時保存于pH<4.5,臨用時以1mol/LNaOH調(diào)至pH7.0。1.2tpo與ald的共表達方式質(zhì)粒pTrcFBP由質(zhì)粒pE1FBP經(jīng)StyI/BamHI雙酶解后分離基因片段并克隆進載體pTrc99B的相應位點而得。TPI與ALD的共表達克隆質(zhì)粒pC1AT-1均由本實驗室構(gòu)建;載體pTrc99B和大腸桿菌TG1由中國科學院上海生物化學研究所王恩多教授贈送;質(zhì)粒pDC-8及大腸桿菌菌種HB101由中國科學院植物研究所光合室施定基教授提供。2方法2.13ptrcfat基因共表達方式的分離純化質(zhì)粒pC1AT-1經(jīng)EcoRI/SalI雙酶解,1%瓊脂糖凝膠電泳分離含結(jié)構(gòu)基因的片段,同時以BamHI/SalI雙酶解質(zhì)粒pTrcFBP,1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化大片段(含載體質(zhì)粒和FBPase結(jié)構(gòu)基因),然后上述2個片段與寡核苷酸a、b形成的配對產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,可獲得3個基因的共表達質(zhì)粒pTrcFAT(圖2)。2.23ptrcfat/sali線性質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pDC-8為大腸桿菌和藍藻的穿梭質(zhì)粒載體,含卡那霉素和新霉素抗性。將3個基因共表達質(zhì)粒pTrcFAT與此載體分別用限制性內(nèi)切酶SalI消化后分離線性質(zhì)粒片段再相連,就可獲得含外源基因的穿梭質(zhì)粒。采用2次連接法:0.2～0.3pmolpDC-8/SalI線性質(zhì)粒和3個基因共表達質(zhì)粒pTrcFAT/SalI線性片斷按1∶1摩爾比例在20μl反應體系含50mmol/LTris·HCl,pH7.6,1mmol/LDTT,0.5mmol/LATP,5mmol/LMgCl2和1Wiss單位T4DNA連接酶,～20℃連接24h。取2μl經(jīng)10倍稀釋后,在50mmol/LTris·HCl,pH7.6,1mmol/LDTT,10mmol/LATP,10mmol/LMgCl2的緩沖液中加入1Wiss單位T4DNA連接酶,16℃連接24h后轉(zhuǎn)化經(jīng)PiPe-MgCl2-CaCl2-KCl方法制備的HB101感受態(tài)細胞。2.3多態(tài)性表面活性劑的生長培養(yǎng)過夜的細菌經(jīng)50～100倍稀釋于含氨芐青霉素180mg/L的LB培養(yǎng)基,37℃生長至A6000.6～0.8,加入IPTG至終濃度為0.25mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)8～10h。2.4繪制標準曲線采用Bradford微量定量法,以BSA為標準繪制標準曲線。蛋白質(zhì)表達量的初步確定采用SDS分離,考馬斯亮藍R-250染色后經(jīng)黑度掃描確定。2.5fbpase活性測定三酶體系催化的反應見圖1。測活方法:以DHAP為底物,生成的果糖-6-磷酸以酶偶聯(lián)方法檢測。1ml測活反應體系中含有:100mmol/LTris·HCl,pH8.8,10mmol/LMgCl2,0.5mmol/LEDTA,0.1g/LBSA,0.3mmol/LNADP+,0.6uG-6-PDH,1.24uPGI,1.4mmol/LDHAP,加入待測酶溶液引發(fā)反應,25℃反應幾分鐘后記錄A340的變化。以FBP為底物測定FBPase的活性,生成的果糖-6-磷酸以類似方法檢測。1ml測活反應體系中含有:100mmol/LTris·HCl,pH8.8,10mmol/LMgCl2,0.5mmol/LEDTA,0.1g/LBSA,0.3mmol/LNADP+,0.6uG-6-PDH,1.24uPGI及待測酶溶液,25℃溫育5min,加入FBP至終濃度為0.7mmol/L引發(fā)反應,25℃反應,記錄A340的變化。3結(jié)果3.1．tpo-ald共表達基因重組我們將mRNA3′端相對穩(wěn)定、表達量高且比活高的tpi置于下游,表達量相對較低的fbp置于上游,ald處于中間,在trc啟動子調(diào)控下構(gòu)建共表達體系獲得成功。采用基因重組的方法,將TPI-ALD共表達克隆質(zhì)粒pC1AT-1的結(jié)構(gòu)基因重組入含F(xiàn)BPase結(jié)構(gòu)基因的表達質(zhì)粒pTrcFBP中,使之置于FBPase結(jié)構(gòu)基因的下游,使3個基因共同置于trc啟動子調(diào)控下獲得3個基因的共表達質(zhì)粒pTrcFAT。質(zhì)粒及接頭區(qū)結(jié)構(gòu)見圖2。3.2破菌活性測定上述含trc啟動子調(diào)控下共表達質(zhì)粒的大腸桿菌TG1在LB培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導,3個基因均獲得較高表達(圖3),各占全菌蛋白質(zhì)的5%左右,改用2×YT培養(yǎng)基同時添加0.4mol/L山梨醇,TPI和ALD表達量顯著增加,但FBPase變化不明顯。對破菌上清進行活性測定,結(jié)果列于表1。從測活數(shù)據(jù)我們注意到一個現(xiàn)象:即在2×YT培養(yǎng)基添加山梨醇的條件下,以FBP為底物測得的FBPase活性僅為180u/L左右,而以DHAP為底物測得的三酶體系的活性為705u/L左右,二者有相當大的差別,而LB培養(yǎng)基不加山梨醇則無此現(xiàn)象。我們曾首先構(gòu)建了PL啟動子調(diào)控下3個基因的共表達體系(兩組質(zhì)粒pE1FAT-1和pE1FAT-2的差別僅僅是接頭區(qū)的堿基組成不同),該體系中前2個基因表達量很高,共占菌體總蛋白質(zhì)量的40%左右。但第3個基因的表達量很低,SDS未見其電泳條帶(圖3),超聲破菌后上清液以DHAP為底物也檢測不到活性。我們于是改用trc啟動子調(diào)控的表達體系(pTrc99B)獲得了成功。3.3trp/lac融合的基因共表達方法到目前為止,外源基因在藍藻中的表達所用啟動子主要是PpsbA啟動子,該啟動子來自葉綠體,在葉綠體、大腸桿菌和藍藻中均有較強的啟動基因表達的功能。但由于該啟動子不需要誘導,使表達的不可調(diào)控性往往是表達量低的原因之一。現(xiàn)已證明,有些大腸桿菌的啟動子也可在藍藻中發(fā)揮作用。因此我們試圖將含大腸桿菌強融合啟動子trp/lac(trc啟動子)的pTrcFAT3個基因共表達系統(tǒng)連同質(zhì)粒上的lacIq等位基因(保證trp/lac融合啟動子的完全阻遏)一同接入穿梭載體,試探該啟動子在藍藻中的可調(diào)控表達。通常大質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化效率均較低,我們采用常規(guī)的方法嘗試了幾次均未能成功。最后通過制備高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化效率1×109～3×109cfu/μgpBR322DNA),采用高濃度的線性片斷較高溫度連接使之先形成分子間聚合體,然后低濃度低溫連接進一步分子內(nèi)環(huán)化的二次連接法獲得成功。按圖4所示路線構(gòu)建FBPase-ALD-TPI的3個基因的大腸桿菌-藍藻穿梭表達質(zhì)粒,結(jié)果除獲得正常的重組質(zhì)粒pDCFAT-1(16.4kb)外,還意外地獲得了載體質(zhì)粒pDC-8的線性片斷與pTrcFAT的線性片斷按1∶2形成的含兩組操縱子的質(zhì)粒pDCFAT-2(23.6kb)。3.4葡萄糖-6-磷酸dmps活性測定接種含重組質(zhì)粒pDCFAT的大腸桿菌HB101于LB培養(yǎng)基,IPTG誘導表達,發(fā)現(xiàn)兩組質(zhì)粒均獲得了穩(wěn)定的表達,但表達量有明顯的差異,其中pDCFAT-2的表達量比pDCFAT-1高出很多(圖5)。收集誘導表達后的菌體,STE