杏鮑菇和乳白耙齒菌錳過氧化物酶活性的研究

杏鮑菇和乳白耙齒菌錳過氧化物酶活性的研究

木材白腐菌在分解木質(zhì)素時會產(chǎn)生非特異性分解木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的酶系統(tǒng)。這些酶系統(tǒng)主要包括：細(xì)胞外誘導(dǎo)酶（mps）、木質(zhì)素氧化酶（ligosimase，lp）和細(xì)胞外酚氧化酶[lacase]。因此,白腐菌能夠有效地降解廢水和土壤中難被降解的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、DDT、染料、炸藥和其它氯化物、疊氮化合物等,在生物修復(fù)方面具有重要作用杏鮑菇(Pleurotuseryngii)和乳白耙齒菌(Irpexlacteus)是能夠引起木材腐朽的兩種擔(dān)子菌目前國內(nèi)對杏鮑菇在栽培技術(shù)方面的研究較多本文對杏鮑菇和乳白耙齒菌在以低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基LNAS,LowNitrogenAsparagineSuc-cinicacid)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并在4種不同的酶作用底物條件下,對MnP的活性進行了檢測,目的是搞清杏鮑菇和乳白耙齒菌是否產(chǎn)生MnP及其與培養(yǎng)基的成分和酶作用的底物等條件的關(guān)系,為進一步利用其產(chǎn)木質(zhì)素降解酶和深入研究兩種真菌分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)的作用機理與木質(zhì)素降解機制的關(guān)系,以及基因表達調(diào)控等分子生物學(xué)機制提供基礎(chǔ)的酶學(xué)研究。1材料和方法1.1馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基杏鮑菇菌株MD1和乳白耙齒菌菌株CB1由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護學(xué)科森林病蟲病理實驗室提供,實驗前的菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA,PotatoDextroseAgar)斜面上冷藏于4℃冰箱。1.2天冬酰胺-惡意培養(yǎng)基綜合培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基:低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基(LNAS,LowNitrogenAsparagineSuccinicacid)1.3杏鮑菇保藏培養(yǎng)在250mL三角瓶中加入70mLLNAS培養(yǎng)基,分別添加4種不同底物進行菌種培養(yǎng):(1)LNAS培養(yǎng)基不含Mn所有的培養(yǎng)液高壓滅菌15min,接菌前向每個滅菌的三角瓶中加入5mL除菌的15%葡萄糖溶液。保藏菌種先接種至PDA平板培養(yǎng)基(9cm)上,28℃培養(yǎng)杏鮑菇9d、乳白耙齒菌3d,8mm打孔器于培養(yǎng)皿菌絲邊緣打孔,然后將菌餅轉(zhuǎn)接至滅菌后的三角瓶中,每個三角瓶加入5塊菌餅,28℃靜止培養(yǎng),每項試驗設(shè)4個重復(fù)。培養(yǎng)至3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d提取培養(yǎng)液即胞外酶液,每個三角瓶中每次提取酶液1.3mL,將提取的粗酶液離心(13200r,室溫)5min,進行酶活測定后冷藏于-20℃冰箱。1.4dmp氧化的測定MnP的活性可通過紫外-可見分光光度計(Ultrospec4300pro,Amersham)在470nm處檢測2,6-DMP的氧化進行測定2結(jié)果與分析2.1三種培養(yǎng)基中的mph活性物質(zhì)在種不同的培養(yǎng)液中分別對的酶活進行檢測,在470nm處均檢測到吸光值的變化,結(jié)果表明這兩種真菌都能產(chǎn)生MnP。2.2杏寶草和白豆齒的培養(yǎng)液1的酶活性試驗結(jié)果表明杏鮑菇和乳白耙齒菌在不含Mn2.3杏鮑菌和乳液2的酶活性試驗杏鮑菇和乳白耙齒菌在含Mn2.4通過酶活性測定杏鮑菌和胸骨白鼠牙3杏鮑菇和乳白耙齒菌在含Mn2.5杏鮑菌和乳液4的酶活性試驗杏鮑菇和乳白耙齒菌在含Mn2.6杏鮑菇mnp活性的變化在4種不同的培養(yǎng)液中,杏鮑菇和乳白耙齒菌的MnP活性變化是有規(guī)律的,在第3d即檢測到,只是活性很低,以后總體呈升高趨勢,且均在第13d達到最高,以后總體呈下降趨勢,但在第21d并沒有降為零;在相同的培養(yǎng)方式下,杏鮑菇MnP活性在13d以后下降速率比乳白耙齒菌更慢一些且杏鮑菇MnP活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乳白耙齒菌(圖1～8)。杏鮑菇和乳白耙齒菌MnP在有無Mn3培養(yǎng)基對mnp活性的測定本文采用LNAS培養(yǎng)基在4種不同培養(yǎng)液中對白腐菌杏鮑菇和乳白耙齒菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)的主要酶系之一MnP的活性進行了檢測。結(jié)果表明,杏鮑菇和乳白耙齒菌均可產(chǎn)生MnP,酶的活性變化是有規(guī)律的,兩種菌在不同培養(yǎng)液中MnP活性均在第13d時達到最高。通過MnP酶活性的檢測,獲得了酶與培養(yǎng)基的成分和酶作用的底物等條件的關(guān)系。4種培養(yǎng)液的酶活力測定結(jié)果表明:(1)有Mn本文對MnP的酶活檢測,選擇了限制營養(yǎng)型基礎(chǔ)培養(yǎng)基低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基,以便可以更加靈敏地檢測分泌量較少的MnP,因此酶活相對于選擇富營養(yǎng)型培養(yǎng)基較低,同時最大產(chǎn)酶時間稍有延后。本項試驗尚未進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,這可能是導(dǎo)致酶活較低的一個原因,因此如需要提高酶活力、縮短產(chǎn)酶時間,還需進一步選擇富營養(yǎng)型培養(yǎng)基并對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化本試驗研究結(jié)果還表明:Mn不是杏鮑菇和乳白耙齒菌產(chǎn)生MnP的必要因子。這與前人對其他白腐菌的研究結(jié)果不同。以前的