兩種大鼠肝癌模型的建立

兩種大鼠肝癌模型的建立

現(xiàn)在有很多關(guān)于肝腫瘤的研究。研究人員通常使用大鼠癌模型研究肝腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療。肝癌模型的制備方法比較多,包括自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、基因工程肝癌模型、注射式肝癌模型。自發(fā)性模型雖然與人類的發(fā)病機理、發(fā)病過程很相似,但是腫瘤發(fā)生率比較低且不穩(wěn)定。誘發(fā)性肝癌模型起病隱匿、病程較長,腫瘤多為彌漫結(jié)節(jié)型,合并或不合并肝硬化?；蚬こ谈伟┠Ｐ蜑楦伟┑幕A(chǔ)理論和臨床研究開辟更為理想的途徑,但技術(shù)要求極高,價格昂貴實驗研究中常用到的有誘發(fā)性肝癌模型和移植性肝癌模型1材料和方法1.1單只提取ndf1SPF級Wistar大鼠,雄性,70~100g,30只。購自于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(新)2016-0003。1.2材料表面Walker-256細(xì)胞株,購自于上海通派生物細(xì)胞庫,貨號walker256細(xì)胞株。1.3方法1.3.1組織研磨法Walker-256細(xì)胞接種于Wistar大鼠腋下,待腫瘤組織長出大約1cm時,將腫瘤組織取出,剔除纖維包膜及壞死組織,超凈工作臺中在無菌平皿中剪碎,將腫瘤組織放入組織研磨器中,加入少量4℃生理鹽水輕輕研磨成勻漿,80目的細(xì)胞篩過濾成瘤細(xì)胞懸液,用生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度至101.3.2大鼠培育中卡氏原螯蝦Walker-256細(xì)胞,接種于Wistar大鼠腹腔,傳代2代后收集腹水,離心,棄去上清液,留試管下層白色腫瘤細(xì)胞液體,將試管放入碎冰中備用。1.3.3肝臟造模的制備30只雄性Wistar大鼠隨機分為3組,腫瘤組織研磨組、腫瘤細(xì)胞腹水懸液組、空白對照組,每組10只,腫瘤組織研磨組(模型1)采用腫瘤組織研磨得到細(xì)胞懸液注射肝臟造模;腫瘤細(xì)胞腹水懸液組(模型2)采用腫瘤細(xì)胞腹腔接種傳2代后得到的腹水注射肝臟造模;空白對照組采用0.9%生理鹽水注射肝臟造模。造模前將大鼠用3%的戊巴比妥鈉按照0.1mL/100g的劑量,腹腔注射進行麻醉。待大鼠進入深度麻醉狀態(tài)后,將大鼠仰臥于試驗臺接種造模物質(zhì)。注射部位在大鼠劍突下約0.5cm,稍偏右側(cè)的位置,注射時先將此部位的皮膚提起,將針頭刺入皮下,然后再將針頭垂直進針刺入肝臟,進針深度約0.5cm,接種完成后拔出針頭,按壓進針部位3~5min。各組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng),每日觀察大鼠的飲食、大小便、腹圍及精神狀態(tài),分組及造模情況見表1。1.3.4可以分離血清的大鼠血清各組注射造模物質(zhì)后,各組大鼠每日均正常飲食,觀察并記錄動物生長情況,于實驗第21天禁食不禁水,12h后眼眶靜脈叢取血,分離血清,觀察血液指標(biāo)。頸椎脫白處死大鼠并解剖。取出肝左葉,放入10%的福爾馬林中固定,HE染色法制作病理切片,觀察腫瘤生長情況。2結(jié)果2.1大鼠肝臟疾病的狀況,大鼠一般在半干研磨組出現(xiàn)正常腫瘤組織研磨組和腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的大鼠在接種造模物質(zhì)第5天后較空白對照組出現(xiàn)不同程度的豎毛、精神萎靡、活動減少、采食量下降、消瘦等狀況,腫瘤組織研磨組中有2只大鼠出現(xiàn)腹水。各組大鼠于造模物質(zhì)接種10d后頸椎脫臼處死,解剖取出肝臟進行觀察。空白對照組的肝臟為見腫瘤瘤體,腫瘤組織研磨組和腫瘤細(xì)胞腹水懸液組可見略突出于肝臟表面的乳白色菜花樣占位性瘤體,腫瘤組織研磨組的瘤體平均直徑為0.2~0.5cm,腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的瘤體平均直徑為1~2cm。將瘤體剪開可見瘤體為實性、奶酪狀乳白色組織,各組造模結(jié)果見表2。3討論3.1造模成功的實驗通過兩次預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),在進行Walker-256細(xì)胞腹腔傳代時必須選取Wistar大鼠才能造模成功。第一次實驗時使用SD大鼠接種腹腔,并未得到腫瘤腹水。在進行腫瘤細(xì)胞肝臟接種時也必須使用Wistar造模才能成功。本實驗大鼠的質(zhì)量需要控制在70～100g的范圍內(nèi),若Walker-256細(xì)胞接種在超過100g的Wistar大鼠肝臟內(nèi),造模成功率很低。3.2實性乳瘤的采集(1)在采集大鼠腋下瘤體時需要把握時機。(2)大鼠腋下接種后第10天即可采集瘤體,此時瘤體大約1cm大小,手感稍有彈性,剖檢可見瘤體為實性奶酪樣組織,此時采集瘤體做細(xì)胞懸液最合適。(3)當(dāng)接種時間超過10d后,瘤體有中空的感覺,剖檢后發(fā)現(xiàn)瘤體中間有血性液體,瘤體邊界呈現(xiàn)灰白色,組織易碎,采用瘤體制作的細(xì)胞懸液在鏡下觀察活細(xì)胞計數(shù)無法達(dá)到103.3有惡意程序出現(xiàn)不良反應(yīng),3本課題組通過反復(fù)實驗證實,在進行癌細(xì)胞肝臟接種時,大鼠必須處于深度麻醉狀態(tài),否則在注射進針時大鼠扭動身體將影響接種效果。接種完畢后拔針的同時壓住進針部位3min以上,否則會造成造模物質(zhì)逆流進入腹腔產(chǎn)生惡性腹水。產(chǎn)生惡性腹水后10d左右大鼠將會出現(xiàn)死亡的情況。本次實驗中腫瘤組織研磨組中有2只大鼠造模未成功,剖檢觀察發(fā)現(xiàn),肝臟上未出現(xiàn)瘤體,腹腔內(nèi)有大量紅色惡性腹水,可能是接種時針頭未進入肝臟,造模物質(zhì)直接進入腹腔所致。3.4細(xì)胞平臺研磨法本研究通過對比分析發(fā)現(xiàn),腫瘤組織研磨組的肝臟瘤體小于腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的瘤體。說明腫瘤細(xì)胞腹水懸液制作的肝癌模型的瘤體生長速度大于腫瘤組織研磨組,腫瘤細(xì)胞腹水懸液制作的模型更適合用于與腫瘤生長和抑制生長相關(guān)的課題研究,而腫瘤組織研磨得到的細(xì)胞液則更合適用于實驗周期長的研究。由于本次實驗旨在探索肝癌模型制作方法,因此,在接種瘤細(xì)胞第10天時結(jié)束實驗,未繼續(xù)觀察大鼠在第10天以后的狀態(tài),以及大鼠因肝癌造成的死亡時間,這些均有待今后進一步研究。3.5腫瘤細(xì)胞織入血府的中央靜脈和織物質(zhì)通過病理切片的觀察,本研究發(fā)現(xiàn)兩組模型的腫瘤細(xì)胞在形態(tài)和排列上沒有差別。從肝小葉的基本結(jié)構(gòu)觀察,腫瘤組織研磨組的肝小葉比較完整,腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的肝小葉基本破壞,說明腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的肝臟損傷程度更為嚴(yán)重。對中央靜脈中的細(xì)胞進一步觀察后發(fā)現(xiàn),兩組模型的中央靜脈里均存在有腫瘤細(xì)胞,表明腫瘤細(xì)胞已經(jīng)進入血液,并向全身轉(zhuǎn)移,與腫瘤組織研磨組相比較,腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的中央靜脈中的腫瘤細(xì)胞更多,提示腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的全身轉(zhuǎn)移速度可能更快。光學(xué)顯微鏡下觀察,腫瘤組織研磨組的肝小葉基本可見,肝細(xì)胞輕微水腫,肝血竇擴張,腫瘤細(xì)胞呈團塊狀分布,中央靜脈中可見有腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞腹水懸液組的腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布,巢中有不同程度的出血壞死狀況,肝小