雞紅細(xì)胞的血凝和血凝抑制試驗

雞紅細(xì)胞的血凝和血凝抑制試驗

在獸醫(yī)實驗室，通常進行血凝和血凝抑制試驗，評估以引起感染和新城病為血凝性病毒，或診斷出具有血凝性的疾病，并對疾病群的免疫狀態(tài)進行評估。1定義和原則1.1血液抑制某些病毒或病毒的血凝素,能選擇性的使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集,這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝。1.2種抗體的量當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體,且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r,則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接反應(yīng),也稱血凝抑制反應(yīng)。2雞紅細(xì)胞制備試驗自備器材、試劑;領(lǐng)取病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清;制備1%雞紅細(xì)胞;血凝試驗,判定;4HAU回滴;稀釋抗原;血凝抑制試驗;判定結(jié)果。2.1獨立設(shè)備和試劑96孔V型反應(yīng)板,微量移液器、阿氏液、pH7.20.01mol/LPBS液。2.2接受抗感染領(lǐng)取禽流感或新城疫抗原及相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。2.31%紅血球的制備取3只或3只以上SPF公雞或無禽流感和新城疫等病原感染的的健康公雞的血液與阿氏液等體積混勻,用PBS液(pH7.2、0.01mol/L)反復(fù)洗滌3次,每次以2000轉(zhuǎn)/min(用于新城疫抗體檢測))或1000轉(zhuǎn)/min(用于禽流感抗體檢測)離心10min,洗滌后的紅血球與PBS液混合均勻,配置成1%的紅細(xì)胞懸液,置4℃冰箱冷藏。2.4根據(jù)gb/t386-2003和gb/t6550-2008新城區(qū)流行病的診斷技術(shù)，進行了血凝試驗、4hau回流、抗凝試驗和血凝抑制試驗2.5陽性對照孔血清是否超過1個滴度的誤差以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。陰性對照孔血清滴度小于或等于2log2,陽性對照孔血清不超過1個滴度的誤差,作為實驗成立的先決條件。以禽流感為例,HI≤3log2判定HI試驗結(jié)果為陰性;HI價=4log2試驗結(jié)果為可疑,需要重復(fù)試驗,HI≥5log2試驗結(jié)果為陽性。3血液抑制和血液抑制試驗的注意事項3.14抗高血壓藥物的最佳制備3.2抗逆滴加序列每次向板內(nèi)滴加抗原時,移液器滴頭要與平面45度懸空,不要觸碰到孔內(nèi)的液體,由后向前依次滴加(即濃度由低往高滴加)。3.3抗感染反應(yīng)期抗原抗體在室溫20~25℃下,必須反應(yīng)30min以上,若環(huán)境溫度低于室溫,可將微量反應(yīng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中,使二者充分反應(yīng)。3.4旅游溫度磷酸鹽緩沖液的pH值要在高壓滅菌后進行滴定,往往在高壓后pH值會有所改變,所以高壓后再調(diào)一次pH值更為準(zhǔn)確。磷酸鹽緩沖液一經(jīng)使用保存期不要超過3周。當(dāng)pH<5.8時,紅細(xì)胞會產(chǎn)生自凝現(xiàn)象;當(dāng)pH>7.8時,圖形洗脫加快,易造成肉眼觀察產(chǎn)生誤差;pH=7.2時,紅細(xì)胞沉降最充分,圖形最清晰。3.5只剩下3個將雞血放置于15mL離心管內(nèi)進行洗滌,避免使用1.5~2mL離心管洗滌。3.6當(dāng)?shù)巫?%紅細(xì)胞懸液時，應(yīng)經(jīng)常搖晃紅細(xì)胞懸液，使紅細(xì)胞均勻地分布在磷酸緩沖液中，以防止紅細(xì)胞下降3.7反應(yīng)時間及溫度加入雞紅血球之后,反應(yīng)板在室溫(20~25℃)靜置30~40min,對照孔血球下沉于孔底,即可判定結(jié)果。若室溫達(dá)不到實驗要求,需相應(yīng)調(diào)整反應(yīng)時間。當(dāng)環(huán)境溫度低于4℃時,紅細(xì)胞發(fā)生自凝;高于37℃時,會發(fā)生反應(yīng)物分離和紅細(xì)胞溶血。3.8滌雞紅細(xì)胞離心轉(zhuǎn)數(shù)1000RPM,離心10min;檢測新城疫抗體時,洗滌雞紅細(xì)胞離心轉(zhuǎn)