克氏原螯蝦致白斑綜合癥病毒陽性死亡一例

克氏原螯蝦致白斑綜合癥病毒陽性死亡一例

根據(jù)研究，克氏原頭蝦（cyli）通常被稱為“小龍蝦”。它屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼類、甲殼類、頭足目、甲殼類、上升科、上升科等科。1材料方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.1.2測(cè)試試劑1.2組織病理學(xué)觀察將患病克氏原螯蝦冰凍麻醉后剖檢。首先進(jìn)行體表完整性及體表癥狀觀察，接著打開頭胸甲，觀察鰓，肝胰腺等大體病變情況，并迅速采集鰓、心臟、肝胰腺、胃腸道和腹節(jié)肌肉，分別取少量組織用液氮快速凍存后放入-80℃條件下保存，剩余組織放入AFA固定液中保存。1.3病蝦體內(nèi)wssv的pcr檢測(cè)根據(jù)大體病理觀察推測(cè)出患病蝦的病變由感染W(wǎng)SSV引起，通過PCR檢測(cè)鑒定，參照何琪瑤1.4系統(tǒng)進(jìn)化分析將測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST查找同源性序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列編輯和比對(duì)分析，此外，利用MEGA7.0鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。1.5組織病理學(xué)檢查將AFA液固定的鰓、心臟、肝胰腺、腸道、腹節(jié)肌肉和眼睛取出，鰓、腹節(jié)肌肉和眼睛用脫鈣液脫鈣5h，接著水洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片（3μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理損傷，并拍照記錄。2結(jié)果2.1蝦內(nèi)臟器變化患病克氏原螯蝦主要臨床癥狀為體色變暗、攝食減少、活力較差（圖1A）。剖解后發(fā)現(xiàn)，病蝦內(nèi)臟器官大體病變不典型，主要表現(xiàn)為部分腸段中空無食物，腸壁透明，腸管較細(xì)（圖1B-C）；其余器官如肝胰腺、鰓等無明顯變化。2.2wssv內(nèi)引物篩選將-80℃保存的鰓、肝胰腺、腸道和肌肉進(jìn)行混合勻漿，提取混合組織的DNA，用WSSV外引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，所有樣品均擴(kuò)增出一條1447bp的特異性條帶（圖2A）。接著使用WSSV內(nèi)引物對(duì)樣品進(jìn)行套氏PCR檢測(cè)，所有樣品均擴(kuò)增出一條約940bp的條帶（圖2B）。套氏PCR產(chǎn)物經(jīng)成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定后，獲得長(zhǎng)度為941bp的序列。通過BLAST比對(duì)，顯示該序列與GenBank中WSSV有100%的同源性，確定本次患病克氏原螯蝦體內(nèi)檢測(cè)病毒為WSSV陽性。2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建將測(cè)定序列結(jié)果分別命名為xgq-1、xgq-2和xgq-3，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，該基因序列與WSSV聚為一簇，與印度株（MH883318.1）、墨西哥株（MG432482.1）和中國株（KX686117.1）等序列同源性為100%，進(jìn)一步確認(rèn)患病克氏原螯蝦體內(nèi)攜帶有WSSV。2.4肝胰腺組織病理學(xué)表現(xiàn)經(jīng)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)患病蝦各組織存在如下病變。肝胰腺：患病克氏原螯蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)松散，但管腔結(jié)構(gòu)仍然存在，分界較明顯。低倍下可見肝小管管腔擴(kuò)張，星型結(jié)構(gòu)消失，部分肝細(xì)胞壞死、崩解，使肝小管斷裂，殘缺（圖4A）；高倍下可見間質(zhì)有不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4B），此外還可見部分肝細(xì)胞胞核染色質(zhì)濃縮，胞核崩解、碎裂（圖4C）。表現(xiàn)為中度至重度壞死性肝胰腺炎，鰓：可見鰓絲及鰓小片血腔嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，充盈（圖4D）；鰓絲入鰓動(dòng)脈和出鰓動(dòng)脈內(nèi)均可見大量炎性細(xì)胞（圖4E）；高倍下可見柱細(xì)胞極度腫脹，少量壞死（圖4F）。表現(xiàn)為中度充血性鰓炎。心臟：有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域嗜堿性染色增強(qiáng)（圖4G）；高倍下可觀察到大量壞死細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞（圖4H）。表現(xiàn)為中度壞死性心肌炎。腸道：可在黏膜下層見到呈團(tuán)分布的炎性細(xì)胞，其余病理變化不典型（圖4I）。腸道表現(xiàn)為輕度腸炎。其他組織器官無明顯組織病理表現(xiàn)。3克氏原螯蝦wssv的研究進(jìn)展目前，WSSV檢測(cè)方法較多，需篩選一種較為簡(jiǎn)捷且準(zhǔn)確度高的方法。套式PCR檢測(cè)法組織病理學(xué)診斷法亦是判斷白斑綜合征（whitespotdisease,WSD）的重要方法，由于WSD組織病理學(xué)研究起步較晚，且主要以研究對(duì)蝦為主，目前關(guān)于克氏原螯蝦感染W(wǎng)SD的組織病理學(xué)研究相對(duì)缺乏、水平不高，由于病變特征不明，攻擊靶器官不清，阻礙了對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的深入理解。建立完善的組織病理變化標(biāo)準(zhǔn)，以期為克氏原螯蝦WSSV的鑒定提供參考。本研究中患病克氏原螯蝦表現(xiàn)為明顯的中度至重度壞死性肝胰腺炎、中度充血性鰓炎、以及輕度腸炎，與魏克強(qiáng)近年來，克氏原螯蝦需求大增，市場(chǎng)往往供不應(yīng)求，進(jìn)一步刺激了該品種的擴(kuò)張性養(yǎng)殖。因此，對(duì)養(yǎng)殖過程中疾病的控制尤為重要。WSSV對(duì)水生甲殼類動(dòng)物危害極大，是克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中的主要威脅。疫苗是病毒病的防治最有效的手段，目前，已研