新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

在克氏原蝦繁殖過程中，由于環(huán)境的變化，水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的池底和水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌、病毒和附生生物常導(dǎo)致蝦病。新型苯扎溴銨作為蝦養(yǎng)殖過程中的疾病治療及水體消毒劑使用隨著養(yǎng)殖水環(huán)境及藥物濫用的發(fā)生,常引發(fā)各種疾病,而固著纖毛蟲病是蝦蟹養(yǎng)殖過程中的主要疾病,其由累枝蟲、聚縮蟲、鐘形蟲等附著類纖毛蟲寄生在蝦眼鰓及體表上引發(fā)的一類寄生蟲疾病。目前這類治療這類疾病的藥物不少,作為最早開始使用的藥物,孔雀石綠對(duì)固著纖毛蟲有很好的殺滅效果,但因其高毒性、用藥后生物體內(nèi)殘留時(shí)間長以及“三致”等毒副作用。早在2002年已被國家列入禁用藥清單。此外有硫酸銨、硫酸銅、高錳酸鉀、甲醛或戊二醛及代森類制劑還有傳統(tǒng)中草藥制劑,但這些藥物有的成本過高,有的毒副作用大,有的還是禁用藥1材料和方法1.1材料表面1.1.1正常、規(guī)格、無病無傷克氏原螯蝦購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)貿(mào)易市場,體長(8.9±0.6)cm,體質(zhì)量(31.5±1.5)g/尾,體態(tài)正常、規(guī)格整齊、無病無傷。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用曝氣48h以上的脫氯自來水馴養(yǎng)1周,每天正常投飼和換水,及時(shí)剔除攝食和運(yùn)動(dòng)不正常的個(gè)體,每天記錄病死率,當(dāng)病死率穩(wěn)定在5%以下時(shí)方可用于實(shí)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天停止投飼,正常換水,確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于空腸狀態(tài)。1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物1.1.3u3000實(shí)驗(yàn)方法暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)期間的實(shí)驗(yàn)用水是經(jīng)過48h以上曝氣處理的脫氯自來水,平均水溫(18±1)℃,pH值7.5,溶氧量4.5~5.5μL/L,實(shí)驗(yàn)采用自然光照。實(shí)驗(yàn)容器是半透明水族箱,在使用之前用高錳酸鉀溶液清洗浸泡消毒,清洗晾干。實(shí)驗(yàn)之前用設(shè)計(jì)濃度實(shí)驗(yàn)藥品浸泡容器24h,減少實(shí)驗(yàn)中容器對(duì)藥品的吸附,最后向每個(gè)容器中加入40L實(shí)驗(yàn)用水并加入新配的相應(yīng)濃度藥品,從低濃度組向高濃度組依次各放入相同數(shù)量、規(guī)格一致、體質(zhì)健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1.2動(dòng)物的急性毒性實(shí)驗(yàn)采用靜水實(shí)驗(yàn)法根據(jù)藥物的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在濃度間分別按等差和等比設(shè)計(jì)4個(gè)濃度梯度,用蒸餾水溶解實(shí)驗(yàn)藥品并按照設(shè)計(jì)濃度梯度配置成便于取用的高濃度母液。臨用時(shí),用移液槍移取定量母液稀釋成最高濃度組的設(shè)計(jì)濃度,然后按照等比濃度梯度稀釋法稀釋得到剩下四個(gè)濃度的藥液。然后向各實(shí)驗(yàn)容器中加入40L經(jīng)48h曝氣自來水,再對(duì)應(yīng)加入配好藥液,從低濃度組向高濃度組依次放入規(guī)格一致、活潑健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并設(shè)平行組和不加藥的空白對(duì)照組。每24h換一次水,換水量為20L,每次換水前按濃度要求配置好,換水時(shí)從低濃度向高濃度進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)過程中需要每天觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的反常行為、外觀變化、中毒癥狀、死亡等現(xiàn)象。中毒后,多次刺激后無反應(yīng),放置在清水中30min后仍無反應(yīng)則判定為死亡,及時(shí)撈出死亡個(gè)體記錄死亡數(shù)量計(jì)算病死率。根據(jù)改良寇氏法計(jì)算苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的安全濃度。1.2.1分組、給藥與實(shí)驗(yàn)組將藥品稀釋或溶解配置成便于計(jì)算取用的高濃度母液,按照等比濃度梯度稀釋法配置藥液獲得5個(gè)濃度梯度,從各試管中移取一定體積藥液按標(biāo)記加入實(shí)驗(yàn)容器中形成5個(gè)濃度組,實(shí)驗(yàn)設(shè)一個(gè)不加藥物的對(duì)照組。新型苯扎溴銨實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度組加入11尾規(guī)格一致、肢體健全、健康的克氏原螯蝦。觀察96h,記錄24、48、72、96h病死率,得到克氏原螯蝦對(duì)新型苯扎溴銨耐受濃度和100%致死的藥液濃度。1.2.2消毒、清洗、飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)藥品需要提前配制好便于計(jì)算取用的高濃度母液。容器需要進(jìn)行標(biāo)記編號(hào),上面有實(shí)驗(yàn)藥品種類、濃度、開始時(shí)間。先用高錳酸鉀溶液消毒、再用對(duì)應(yīng)濃度的藥品浸泡24h。用清洗消毒的水族箱盛滿自來水,48h不間斷增氧曝氣脫氯用作實(shí)驗(yàn)用水。蝦在實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)一周,馴養(yǎng)期間正常投飼、換水,實(shí)驗(yàn)前48h停止喂食以排空腸道,在實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物挑選、測量記錄體長體質(zhì)量。新型苯扎溴銨組每個(gè)濃度投放6尾克氏原螯蝦。1.2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與觀察記錄新型苯扎溴銨實(shí)驗(yàn)藥液配置采用等比稀釋法,先取用一定量高濃度母液稀釋得到6號(hào)濃度組的加藥濃度。通過等比稀釋獲得新型苯扎溴銨的其余5個(gè)濃度的藥液。配好的藥液用移液管量取定量藥液加入對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)容器,配置好實(shí)驗(yàn)組溶液,然后按照低濃度到高濃度的方向放入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。同一濃度設(shè)平行組,實(shí)驗(yàn)設(shè)不加藥的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)時(shí)間不投飼,每24h換1/2的水,并加藥保持原有濃度不變。實(shí)驗(yàn)開始后每24h觀察記錄一次水溫、pH及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)情況、中毒反應(yīng)、死亡情況。發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體及時(shí)記錄、撈出。1.3平均病死率的計(jì)算數(shù)據(jù)采用Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì),根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況列表得出每個(gè)濃度的平均病死率,用改良寇氏法公式(1)計(jì)算半數(shù)致死濃度式中:X2結(jié)果2.1螯足、附肢體生長實(shí)驗(yàn)中,向32μL/L濃度組中放入試驗(yàn)蝦后,出現(xiàn)中毒初期癥狀,蝦活動(dòng)劇烈,快速移動(dòng),此時(shí)用玻璃棒刺激會(huì)出現(xiàn)正常的抵御反應(yīng);藥物作用一段時(shí)間后,活動(dòng)能力減弱,螯足附肢收縮、僵硬、附肢出現(xiàn)抽搐,有的能爬行,行進(jìn)非常緩慢,且動(dòng)作僵硬不連貫,有的側(cè)躺、仰臥,失去運(yùn)動(dòng)能力,用玻璃棒刺激尾部無任何抵御反應(yīng);24h內(nèi)全部死亡,死亡時(shí)螯足、附肢僵硬呈收縮緊抱狀態(tài),正常缺氧致死的蝦肢腳呈伸展癱瘓狀態(tài)。8μL/L和16μL/L濃度組出現(xiàn)中毒癥狀,活動(dòng)能力減弱,瀕死的個(gè)體側(cè)躺、仰臥,失去運(yùn)動(dòng)能力,在48~96h期間大規(guī)模出現(xiàn)蝦的回避反應(yīng),側(cè)身附著在箱壁露出水面。2.2急性毒性判定新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。在新型苯扎溴銨中克氏原螯蝦24、48、72、96h的LC以96h半致死質(zhì)量濃度為評(píng)判對(duì)象,依據(jù)國家環(huán)境保護(hù)局給出的新化學(xué)藥品對(duì)魚類急性毒性的危害等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(見表3)可知新型苯扎溴銨制劑屬于高毒藥物。3控制好用量,避免在一定時(shí)間上給克氏原螯蝦造成危害根據(jù)新型溴銨產(chǎn)品說明,其治療固著纖毛蟲病如蟹居江氏偽鐘蟲的潑灑濃度0.35μL/L,施用濃度低于其對(duì)克氏原螯蝦的安全濃度0.7μL/L。因此在一定濃度范圍