血紅蛋白的提取和分離

血紅蛋白的提取和分離

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一般高中課程標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)教科書——生物選修1[人教版]課題3血紅蛋白的提取和分別★課題目標(biāo)一學(xué)問與技能1、嘗試從血液中提取和分別血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分別生物大分子的基本原理二過程與方法體驗(yàn)血紅蛋白提取和分別的試驗(yàn)的嚴(yán)格要求,留意根據(jù)操作提示進(jìn)行相關(guān)步驟三情感、態(tài)度與價(jià)值觀初步形成科學(xué)的思維方式,進(jìn)展科學(xué)素養(yǎng)和人文精神★課題重點(diǎn)凝膠色譜法的原理和方法★課題難點(diǎn)樣品的預(yù)處理;色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填★教學(xué)方法啟發(fā)式教學(xué)★教學(xué)工具多媒體課件★教學(xué)過程-可編輯修改-:..。

一引入新課蛋白質(zhì)是生命活動的主要擔(dān)當(dāng)者,是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化和物。

對蛋白質(zhì)的討論有助于人們對生命過程的熟悉和理解。

所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行討論。

怎樣提取蛋白質(zhì)呢二:外形、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別,由此提取和分別各種蛋白質(zhì)。

安排色譜法:1原理:圖5-13分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流淌快;分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部,路程長,流淌慢。

2凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。

3分別過程:圖5-13混合物上柱→洗脫→大分子流淌快、小分子流淌慢→收集大分子→收集小分子*洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流淌。

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1原理:由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成如-,-,2334等,調(diào)整酸和鹽的用量,可配制不同的緩沖液。

2242緩沖液作用:抵制外界酸、堿對溶液的干擾而保持穩(wěn)定。

:1原理:不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、外形和大小不同,在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同,導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同。

[思索]閱讀教材后,填寫下表:打算運(yùn)動形成庫形成打算運(yùn)動方向侖力阻力速率電荷√性質(zhì)電荷√√量分子√√外形分子√√大小2分別方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰***經(jīng)膠電泳等。

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3分別過程:在肯定下,使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電;加入帶負(fù)電荷多的,形成“蛋白質(zhì)-復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。

樣品處理、粗分別、純化、純度鑒定。

思索:是否全部種類的蛋白質(zhì)的提取和分別都是這樣的為什么不是。

由于蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同,分別方法差別很大。

1你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中,最好哪種血液來提取血紅蛋白為什么哺乳動物血液。

由于該細(xì)胞中沒有細(xì)胞核,血紅蛋白含量高。

2請閱讀教材,熟悉哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。

并思索回答下列問題:血液由和兩部分組成。

血細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量最多,細(xì)胞的含量最高的化合物是。

該化合物是由和構(gòu)成的,其中每個亞基中都含有一個能與和結(jié)22合的基團(tuán)。

:洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分別血紅蛋白、透析。

洗滌紅細(xì)胞的目的是什么除去血漿蛋白的雜蛋白,有利于后續(xù)步驟的分別純化。

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紅細(xì)胞的洗滌過程為血液+檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞+5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10→低速短時離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無黃色思索:加入檸檬酸鈉有何目的為什么要低速、短時離心為什么要緩慢攪拌防止血液凝固;防止白細(xì)胞沉淀;防止紅細(xì)胞裂開釋放出血紅蛋白。

思索:你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來加入蒸餾水,用玻璃棒快速攪拌一段時間。

補(bǔ)充:加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。

加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜,有利于血紅蛋白的釋放和分別。

此時,紅細(xì)胞破裂混合液中不僅含有血紅蛋白,而且還含有細(xì)胞破裂物、脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。

怎樣除去這些雜質(zhì)呢由于它們的密度不同,科學(xué)家實(shí)行了離心分別的方法:紅細(xì)胞破裂混合液→中速長時離心200010→濾紙過濾除去脂質(zhì)→。

透析。

半透膜的選擇透過性,大分子物質(zhì)不能通過半透膜,離子和小分子能夠通過半透膜。

在透析過程中,血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜集中進(jìn)入到=7的磷酸緩沖液中。

思索:為何使用=7的磷酸緩沖液為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量-可編輯修改-:..。

維持血紅蛋白的正常特性。

有利于雜質(zhì)分子充分地向外集中。

總結(jié):通過以上四個基本過程,紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來。

但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子如呼吸酶等。

怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分別開來呢我們來討論蛋白質(zhì)提取和分別的其次個步驟――粗分別凝膠色譜操作。

:制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。

依據(jù)教材圖5-19,說出制作色譜柱需要的材料。

橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。

色譜柱的制作過程:預(yù)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱下面進(jìn)行其次步――凝膠色譜柱的裝填。

請閱讀教材:色譜柱的裝填過程。

步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱量凝膠依據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量凝膠顆粒+蒸餾水→充分溶脹③配制懸浮液凝膠顆粒+洗脫液→沸水浴④裝填懸浮液一次性緩慢倒入;輕小扣打⑤緩沖液洗滌平衡立即用磷酸緩沖液洗滌平衡12樣品加入和洗脫。

其基本過程是:-可編輯修改-:..。

調(diào)整緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)整緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)至此,血紅蛋白即可得到粗分別。

在整個操作過程中,應(yīng)當(dāng)留意以下事項(xiàng):1紅細(xì)胞的洗滌:洗滌次數(shù)不能過少;低速、短時離心。

2凝膠的預(yù)處理:沸水浴法時間短,還能除去微生物和氣泡3色譜柱的裝填:裝填盡量緊密,降低顆粒間隙;無氣泡;洗脫液不能斷流。

4色譜柱勝利標(biāo)志:紅色區(qū)帶勻稱全都地移動。

三課堂總結(jié)、點(diǎn)評血蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性紅蛋凝膠色譜法原理分別過程白凝膠電泳法的提提組成作用緩沖溶液取和蛋白質(zhì)的樣品處理粗分別分分別提取分別純度鑒定純化四實(shí)例探究例1利用凝膠色譜法,什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來-可編輯修改-:..。

:凝集色譜法使依據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分別蛋白質(zhì)的有效方法。

相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程較長,移動速度較慢;相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì),路程較短,移動速度較快,首先洗脫出來。

答案:例2蛋白質(zhì)提取和分別分為哪幾步、凝膠色譜操作、-聚丙烯酰***、凝膠色譜操作、、粗分別、純化、、純化、粗分別、純度鑒定解析:蛋白質(zhì)的提取和分別分為樣品處理、粗分別、純化、純度鑒定四步。

中凝膠色譜操作及-聚丙烯酰***凝膠電泳為試驗(yàn)操作過程中的技術(shù)答案:☆綜合應(yīng)用例3用凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)時,分子量大的蛋白質(zhì)路程較長,移動速度較慢路程較長,移動速度較快路程較短,移動速度較慢路程較短,移動速度較快解析:在小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道,當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時,相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)簡單進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長,移動速度較慢;而相對分子-可編輯修改-:..。

質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動,路程較短,移動速度較快。

答案:五,有何好處-可編輯修改-:..。

,其次層是,,-可編輯修改-:..。

,,-聚丙烯酰***,打開色譜柱下端的流出口,,打開下端出口,,,不要破壞凝膠面答案:★課余作業(yè)-可編輯修改-:..。

1、你能描述血紅蛋白分別的完整過程嗎2、與其他真核細(xì)胞相比較,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)這對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分別和提取有什么意義★教學(xué)體會本課題重在讓同學(xué)了解生物科學(xué)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的進(jìn)展,說明提取、分別高純度的蛋白質(zhì)的重要性和必要性,并一些蛋白質(zhì)分別和提取的基本技術(shù)。

老師可以發(fā)揮同學(xué)的主動性,讓同學(xué)介紹當(dāng)前有關(guān)蛋白質(zhì)討論的新進(jìn)展,激發(fā)同學(xué)的愛好,然后指出本課題的意義,讓薛生初步體會分別純化蛋白質(zhì)的過程和方法★資料袋凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱為安排色譜法,它是依據(jù)分子量的大小分別蛋白質(zhì)的方法之一。

所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體,這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成,小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道,當(dāng)一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時,各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動,即垂直向下的運(yùn)動和無規(guī)章的集中運(yùn)動,相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動速度較快;相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較簡單進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過的路程較長,移動速度較慢。

因此,樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出,相對分子質(zhì)量中等的分子后流出,相對分子質(zhì)量最小的分子最終流出