蘭花DNA的優(yōu)化提取開題報告

蘭花DNA的優(yōu)化提取1.立題依據(jù)1.1論文題目及研究領(lǐng)域1.1.1論文題目:蘭花DNA的優(yōu)化提取1.1.2研究領(lǐng)域:在分子遺傳的應(yīng)用論文研究的理論意義及應(yīng)用價值蘭花一般是指蘭科植物(Orchlidaceae)，它包括五個品種春蘭(Cymbidiumgoe-ring)、蕙蘭(Cymbidium)、寒蘭(CyambidumMakion)、墨蘭(Cymbidiumsinense)建蘭（Censifoli-um）它是鮮花植物中最大科之一，全世界約有800多屬，25000多種，分布于世界各地，大多數(shù)種類分布于東南亞、澳大利亞、中南美洲、非洲和馬達加斯加。我國的野生蘭科植物約有173屬，1240多種，在南北各地均有分布，但以云南、臺灣、海南最為豐富。因而鑒別起來比較困難，而現(xiàn)在采用分子標(biāo)記進行蘭花品種鑒別是一種比較有效的方法，而進行分子標(biāo)記實驗時，DNA的濃度和純度的要求都是相當(dāng)嚴(yán)格的。1.3目前研究的概況和發(fā)展趨勢迄今為止，國內(nèi)外報道的植物DNA提取方法多達好幾十種，如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[4]，十二烷基磺酸鈉(SDS)法[1]，高鹽低pH法[1]，堿裂解法[3]，Zigenhagen法[7]，脲法[6]，DraperandScott法[9]，Csclgradient法[7]，CTAB/Csclgradient法[5]，苯酚法[14]，DNAzolpeagent法[12]。CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)方法和SDS(十二烷基磺酸鈉)方法是目前最常用的兩種[9]，它們都是一種強去污劑。CTAB具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和除大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸，因此，CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘性多糖的植物制備純化DNA[13]。而SDS可使細胞膜及核膜破裂，因此被用來分離DNA[11]。該分離過程的第一步是用熱的去污劑(SDS)進行抽提物置于0℃2.論文研究的內(nèi)容2.1論文重點解決的問題2.2論文擬開展的幾個大方面2.2.1SDS方法和CTAB方法提取2.2.2實驗結(jié)果分析2.2.3結(jié)果討論2.3論文擬得出的主要結(jié)論選擇出蘭花的優(yōu)化提取方法（SDS方法或CTAB方法）3．論文擬采用的研究方法3.1擬采用的主要研究方法用SDS和CTAB方法提取蘭花DNA，并進行比較，通過實驗結(jié)果來選擇蘭花的優(yōu)化提取方法。3.1.1實驗材料都江堰市西川花卉市場購買的材料蘭花包括春蘭(Cymbidiumgoe-ring)、蕙蘭(Cymbidium)、寒蘭(CyambidumMakion)、墨蘭(Cymbidiumsinense)。3.1.2實驗儀器天平、研體和研棒、恒溫水浴鍋、冰盒、泠凍離心機、冰箱、微量離心移液器、微量離心機、50ml離心管等。3.1.3實驗試劑液氮、TBE緩沖液、異丙醇、1×CTAB緩沖液、氯仿/異戊醇(24：1)、0.2mol/ml乙酸納、5×TBE緩沖液等。3.1.4實驗方法3.1.4.11×CTAB法提取蘭花DNA（1）將2g新鮮蘭花葉片用液氮速凍，然后在研體中將其磨碎，在化凍之前將粉末轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯離心管中，然后加入20ml預(yù)熱至90度的1×CTAB提取一離心管中提取緩沖液。輕輕轉(zhuǎn)動離心管，混勻，然后置于65℃水浴放置40分鐘。（2）混合物泠至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇。輕輕顛倒離心管幾次使管內(nèi)混合物構(gòu)成乳狀液。室溫5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘分相。（3）將上清液(水相)轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，37℃保溫30分鐘。（4）加入0.7體積的異丙醇，仔細混勻，室溫放置15分鐘沉淀DNA。（5）用一玻璃鉤將DNA鉤出，并轉(zhuǎn)移至一裝有50ml70%乙醇，0.2mol/L乙酸鈉的干凈離心管中，冰上放置20分鐘，然后轉(zhuǎn)移至一裝有5ml70%乙醇的離心管中，冰上旋轉(zhuǎn)5分鐘。（6）將DNA轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，空氣干燥10分鐘，溶于盡可能少的TE緩沖液(可多達5ml。視DNA的量和純度而定),4℃保存3.1.4.2SDS法提取蘭花DNA（1）將2克新鮮蘭花的葉片置于液氮中速凍，然后在研體中將其磨碎，將泠凍粉末轉(zhuǎn)移至50ml離心管中加入15ml提取緩沖液。輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。（2）加入1ml20%SDS，混勻，65℃保溫10分鐘，并不時輕旋轉(zhuǎn)混勻。（3）加入5ml5mol/L乙酸鉀，混勻后冰上放置20—30分鐘。用14000r/min度離心25分鐘。上清波用紗布過濾，轉(zhuǎn)移至一干凈的50ml離心管中，加入10ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，－20℃放置40分鐘沉淀核酸。（4）然后，在4℃條件下，以2000r/min進行離心，離心20分鐘，去上清液，晾干沉淀5分鐘。用700ul5×TE緩沖液溶解沉淀并轉(zhuǎn)移至一Eppendorf管中。加入75ul3mol/LKAc,輕彈混勻，離心15分鐘沉淀不溶性雜質(zhì)。（5）將上清液轉(zhuǎn)移至一裝有500ul異丙醇的干凈管中，輕輕混勻，室溫下放置5min。微型離心機離心15分鐘沉淀DNA，去上清液并用500ul70%乙醇清洗沉淀。再次離心5min，吸去乙醇。沉淀物溶解于200ulTE緩沖液中，4℃保存。3.1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與結(jié)果分析不同方法提取蘭花DNA的提取率及A260/A280值(表1)方法MethodA260/A280∑/3濃度/(ug/ul)S1S2S3C1C2C3C4_____________________________________________________________________3.2實驗進度安排日期安排內(nèi)容備注2006年9月1—15日選題已完成2006年9月21日—10月查閱資料已完成2006年10月8月—2007年2月實驗實施已完成2007年2月—2007年6月畢業(yè)論文撰寫已完成4．文獻查閱及文獻綜述蘭花DNA的優(yōu)化提取孟超（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院，資源與環(huán)境系，生物技術(shù)專業(yè)，611830）范志霞（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院，資源與環(huán)境系，611830）摘要：我國的蘭花品種繁多，因而鑒別起來比較困難，而現(xiàn)在我們采用分子標(biāo)記進行蘭花品種鑒別是一種比較有效的方法，因而在進行分子標(biāo)記實驗時，DNA的濃度和純度的要求都是相當(dāng)嚴(yán)格的。因此，本實驗采用SDS方法和CTAB方法分別對蘭花的四個品種春蘭(Cymbidiumgoe-ring)、蕙蘭(Cymbidium)、寒蘭(CyambidumMakion)、墨蘭(Cymbidiumsinense)進行DNA提取并進行比較，結(jié)果表明SDS方法是這幾種蘭花DNA的優(yōu)化提取法。關(guān)鍵詞：蘭花；DNA；SDS；CTAB；優(yōu)化提取自2O世紀(jì)8O年代初，分子生物學(xué)大量運用于植物研究領(lǐng)域后，DNA分子標(biāo)記不僅在農(nóng)業(yè)上對植物選種、育種和改良等方面的應(yīng)用穩(wěn)步增長，而且在中藥資源、鑒定、栽培等方面也有著很好的發(fā)展前景。在一般情況下，DNA分子標(biāo)記技術(shù)涉及的分子生物學(xué)原理比較簡單，實驗方法也不復(fù)雜，但熟練掌握、靈活運用，并有效地解決實驗中出現(xiàn)的各種情況，仍有許多問題值得重視。其中，如何有效地提取高質(zhì)量的植物DNA已成為生物化學(xué)研究的一個重要方面。DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，因此DNA的提取應(yīng)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中的最重要、最基本的操作，如不能有效地完成DNA提取，那就無法進行分子生物學(xué)方面的實驗。植物DNA的有效提取，根據(jù)不同研究需要，應(yīng)保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；應(yīng)盡量排除其他大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；應(yīng)保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子，盡可能少地降解。提取DNA的質(zhì)量一般采用核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測。植物DNA的有效提取，它是進行任何DNA工作的前提和基礎(chǔ)，也是最關(guān)鍵的一步。自1980年以來，KerryMullis發(fā)明了PCR技術(shù)，分子生物學(xué)大量運用于植物研究領(lǐng)域后，DNA分子標(biāo)記不僅在農(nóng)業(yè)上對植物選種、育種和改良等方面的應(yīng)用穩(wěn)步增長，而且在花卉資源、鑒定、栽培等方面也有著很好的發(fā)展前景[5]。在一般情況下，DNA分子標(biāo)記技術(shù)涉及的分子生物學(xué)原理比較簡單，實驗方法也不復(fù)雜，但熟練掌握、靈活運用，并有效地解決實驗中出現(xiàn)的各種情況，仍有許多問題值得重視，如提取DNA的質(zhì)量它直接影響后面的實驗流程。參考文獻:[1]熊勁芳,向育君,張正奇．花生總DNA的快速提取與純化研究[J]．生物學(xué)雜志，2003，20(2)：32—34[2]趙艷麗,劉國琴．一種快速提取小麥DNA的方法．鄭州工程學(xué)院學(xué)報[M]，2002，23(3)：62—65.[3]陳心啟．中國蘭花全書[M]．北京：中國林業(yè)出版社，1998．246—256[4]洪付祥,熊金森,熊玲嬡．鶴望蘭基因組DNA的提取方法[J]應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2002，8(4)：366—370[5]邵碧英,陳文炳,李壽崧等．轉(zhuǎn)基因花卉的DNA提取與多重PCR分析[J]．廈門大學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，41(5)：674—678[6]孫曉東,李小丹,郭晏海.經(jīng)濟植物DNA提取與純化的三種方法比較[J]．陜西教育學(xué)院學(xué)報，2003，19(5)：93—94[7]陳慶山，劉春燕,呂東,何建勛．大豆DNA提取基本原理的探討．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報[M]，2004，35(2)：129—134[8]胡薇,孫端,潘曉華．建蘭DNA的快速提取[J]．福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，20(1)：1l8—120[9]沈向，鄭學(xué)勤，任小林，等．核果類基因組DNA提取和RAPD條件優(yōu)選．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)[M]，1999．30(2)：154—160[10]王關(guān)林，方宏筠．植物基因工程(第2版)[M]．北京：科學(xué)出版社．2002．742-749[11]王齊紅,黃驥,張紅生．一種快速微量提取植物葉片DNA的方法．生物技術(shù)通訊[M]，2004，15(5)：479—480[12]王景雪,孫毅,高武軍．一種簡便實用的植物總DNA提取方法．山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)[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