基因工程工具酶限制酶

基因工程工具酶限制酶基因工程工具酶限制酶第1頁(yè)基因工程工具酶限制酶第2頁(yè)一、限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)覺(jué)

限制性核酸內(nèi)切酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來(lái)。依據(jù)1994年美國(guó)出版《分子生物學(xué)百科全書(shū)》統(tǒng)計(jì)數(shù)字，僅Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶一項(xiàng)迄今就已從各種不一樣微生物當(dāng)中，分離出了2300種以上，可識(shí)別230種不一樣DNA序列。早在本世紀(jì)中期，以Arber等人對(duì)入噬菌體在大腸桿菌不一樣菌株上平板培養(yǎng)效應(yīng)研究為基礎(chǔ)，發(fā)覺(jué)了原核生物體內(nèi)存在著寄生控制限制(restriction)和修飾(modification)系統(tǒng)?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?頁(yè)基因工程工具酶限制酶第4頁(yè)

在限制修飾系統(tǒng)中限制作用是指一定類型細(xì)菌能夠經(jīng)過(guò)限制性酶作用，破壞入侵外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞入侵受到限制；

而生物細(xì)胞(如宿主)本身DNA分子合成后，經(jīng)過(guò)修飾酶作用：在堿基中特定位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭本身限制性酶破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用含義?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?頁(yè)2．核酸內(nèi)切限制酶類型

特征I型II型III型限制和修飾活性單一多功效酶分開(kāi)核酸內(nèi)切酶和甲基化酶含有一個(gè)共同亞基雙功效酶核酸內(nèi)切限制酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不一樣亞基單一成份2種不一樣亞基基因工程工具酶限制酶第6頁(yè)切割位點(diǎn)在距寄主特異性位點(diǎn)最少1000bp地方可能隨機(jī)地切割位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近

距寄主特異性位點(diǎn)3，端24~26bp處甲基化作用位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別未甲基化序列進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割能能能序列特異切割不是是是DNA克隆中用處無(wú)用十分有用用處不大基因工程工具酶限制酶第7頁(yè)3．核酸內(nèi)切限制酶命名法

因?yàn)榘l(fā)覺(jué)了大量限制酶，所以需要有一個(gè)統(tǒng)一命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提議命名系統(tǒng)，已被廣大學(xué)者所接收。他們提議命名標(biāo)準(zhǔn)包含以下幾點(diǎn)：（1）用屬名頭一個(gè)字母和種名頭兩個(gè)字母，組成3個(gè)字母略語(yǔ)表示寄主菌物種名稱。比如，大腸桿菌(Escherichia

coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?頁(yè)（2）用一個(gè)寫(xiě)在右下方標(biāo)注字母代表菌株或型，比如Ecok。（3）假如一個(gè)特殊寄主菌株，含有幾個(gè)不一樣限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示。所以，流感嗜血菌Rd菌株幾個(gè)限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII等等。基因工程工具酶限制酶第9頁(yè)（4）全部限制酶，除了總名稱核酸內(nèi)切限制酶R外，還帶有系統(tǒng)名稱，比如核酸內(nèi)切酶R．HindIII。一樣地，修飾酶則在它系統(tǒng)名稱之前加上甲基化酶M名稱。對(duì)應(yīng)于核酸內(nèi)切酶R．HindIII流感嗜血菌Rd菌株修飾酶，命名為甲基化酶M.HindIII。

在實(shí)際應(yīng)用上，這個(gè)命名體系已經(jīng)作了深入簡(jiǎn)化：①因?yàn)楦接袠?biāo)注字母在印刷上很不方便，所以現(xiàn)在通行是把全部略語(yǔ)字母寫(xiě)成一行。②在上下文已經(jīng)交待得十分清楚只包括限制酶地方，核酸內(nèi)切酶名稱R便被省去。基因工程工具酶限制酶第10頁(yè)基因工程工具酶限制酶第11頁(yè)4.Ⅱ型核酸限制性內(nèi)切酶基礎(chǔ)特征

它含有三個(gè)基礎(chǔ)特征：

a.在DNA分子雙鏈特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈斷裂；

b.2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上分布，通常不是彼此直接相正確；

c.

所以，斷裂結(jié)果形成DNA片段，也往往含有互補(bǔ)單鏈延伸末端?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?2頁(yè)a.識(shí)別位點(diǎn)：

絕大多數(shù)II型核酸內(nèi)切限制酶，都能夠識(shí)別由4～8個(gè)核苷酸組成特定核苷酸序列。咱們稱這么序列為核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列。

切割位點(diǎn)一個(gè)共同特點(diǎn)是，它們含有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)形式，換言之，這些核苷酸正確次序是呈回文結(jié)構(gòu)，比如：基因工程工具酶限制酶第13頁(yè)

5'-CTGCAG-3,5'-CTGCAG-3,（a）PstI切割位點(diǎn),

切割后形成3`—OH單鏈粘性末端，3'-GACGTC-5，3'-G+ACGTC-5，(b)EcoRI切割位點(diǎn),切割后形成5`-P單鏈粘性末端，

5'-GAATTC-3’5'-G+AATTC-3’3'-CTTAAG-5’3'-CTTAAG-5’

（c）EcoRV切割位點(diǎn),切割后形成平末端。5'-GATATC-3’5'-GAT+ATC-3’3'-CTATAG-5’3`-CTATAG-5`基因工程工具酶限制酶第14頁(yè)b.

切割類型：

檢驗(yàn)了非常大量試驗(yàn)事例之后發(fā)覺(jué)，由核酸內(nèi)切限制酶作用所造成DNA分子切割類型，通常是屬于下述兩種獨(dú)特排列方式之一：（1）兩條鏈上斷裂位置是交織地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，這種形式斷裂結(jié)果形成含有粘性末端DNA片段；（2）兩條鏈上斷裂位置是處于一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這么形式斷裂是形成含有平末端DNA片段?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?5頁(yè)c.產(chǎn)生末端特征：

咱們所說(shuō)粘性末端是指DNA分子在限制酶作用之下形成含有互補(bǔ)堿基單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠經(jīng)過(guò)互補(bǔ)堿基間配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。

平末端DNA片段則不易于重新環(huán)化?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?6頁(yè)(2)同裂酶(isoschizomers)

有一些起源不一樣限制酶識(shí)別是一樣核苷酸靶序列，這類酶特稱為同裂酶(isoschizomers)。

同裂酶產(chǎn)生一樣切割，形成一樣末端。比如，限制酶HpaⅡ和MspI是一對(duì)同裂酶，共同靶子序列是CCGG?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?7頁(yè)

與同裂酶對(duì)應(yīng)一類限制性內(nèi)切酶,它們即使起源不一樣，識(shí)別靶序列也各不相同,但都能產(chǎn)生相同粘性末端,特稱為同尾酶。常見(jiàn)BamHI,BclI,BglI,XhoI就是一組同尾酶。它們切割DNA之后都形成由-GATC-4個(gè)核苷酸組成粘性末端，很顯然，由同尾酶所產(chǎn)生DNA片段，是能夠經(jīng)過(guò)其粘性末端之間互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)，所以在基因克隆試驗(yàn)中很有用處。(3)同尾酶(isocaudamer)基因工程工具酶限制酶第18頁(yè)

由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生粘性末端共價(jià)結(jié)合形成位點(diǎn)，特稱之為“雜種位點(diǎn)”(hybridsite)。但必須指出，這類雜種位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，普通是不再被原來(lái)任何一個(gè)同尾酶所識(shí)別。比如：SalI（5`-GTCGAC-3`）和XhoI(5`-CTCGAG-3`)消化片段相連，但所形成重組片段（5`-GTCGAG-3`）則不能被上述2種酶任一個(gè)酶識(shí)別和切割。但也有例外?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?9頁(yè)5．影響核酸內(nèi)切限制酶活性原因(1)DNA純度核酸內(nèi)切限制酶消化DNA底物反應(yīng)效率，在很大程度上是取決于所使用DNA本身純度。污染在DNA制劑中一些物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、以及高濃度鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶活性?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?0頁(yè)

為了提升核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA反應(yīng)效率，普通采取以下三種方法：①增加核酸內(nèi)切限制酶用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些。②擴(kuò)充酶催化反應(yīng)體積，以使?jié)撛谝种圃虮粚?duì)應(yīng)地稀釋。③延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)保溫時(shí)間。

在有些DNA制劑中，尤其是按微量堿法制備，會(huì)含有少許DNase污染。因?yàn)镈Nase活性需要有Mg2+存在，而在DNA貯存緩沖液中含有二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA，所以在這種制劑中DNA依然是穩(wěn)定。然而在加入了核酸內(nèi)切限制酶緩沖液之后，DNA則會(huì)被DNase快速地降解掉。要防止發(fā)生這種情況，唯一方法就是使用高純度DNA。

基因工程工具酶限制酶第21頁(yè)(2)DNA甲基化程度

核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制—修飾體系組成個(gè)別，所以識(shí)別序列中特定核苷酸甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地影響酶活性。為防止產(chǎn)生這么問(wèn)題，在基因克隆中使用是失去甲基化酶大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。

基因工程工具酶限制酶第22頁(yè)(3)酶切消化反應(yīng)溫度

DNA消化反應(yīng)溫度，是影響核酸內(nèi)切限制酶活性另一個(gè)主要原因。不一樣核酸內(nèi)切限制酶，含有不一樣最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大變動(dòng)范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有許多例外情況，它們要求37℃以外其它反應(yīng)溫度。其中有些核酸內(nèi)切限制酶最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)37℃，比如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸內(nèi)切限制酶最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)37℃，比如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內(nèi)切限制酶最適反應(yīng)溫度可高達(dá)60℃以上，消化反應(yīng)溫度低于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶活性，甚至最終造成完全失活?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?3頁(yè)DNA分子結(jié)構(gòu)

DNA分子不一樣構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶活性也有很大影響。一些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高可達(dá)20倍。

另外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己處于不一樣部位限制位點(diǎn)，其效率亦有顯著差異。據(jù)推測(cè)，這很可能是因?yàn)閭?cè)翼序列核苷酸成份差造成。

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(5)核酸內(nèi)切限制酶緩沖液

核酸內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組份包含：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性正常發(fā)揮，是絕對(duì)地需要二價(jià)陽(yáng)離子，通常是Mg2+。

對(duì)絕大多數(shù)限制酶來(lái)說(shuō)，在pH=7．4條件下，其功效最正確。

基因工程工具酶限制酶第25頁(yè)

在“非最適”反應(yīng)條件下(包含高濃度核酸內(nèi)切限制酶、高濃度甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外其它位點(diǎn)切割DNA分子。

有些核酸內(nèi)切限制酶切割特異性，受所用緩沖液成份影響比較顯著。比如，最常見(jiàn)EcoRI限制酶，在正常情況下，是在GAATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用，但假如緩沖液中甘油濃度超出5％(V／V)，那么其識(shí)別序列特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶這種特殊識(shí)別能力，通常叫做星號(hào)活性，以EcoRI*表示?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?6頁(yè)6.

限制性內(nèi)切酶反應(yīng)終止

消化DNA樣品后，在深入處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶活性，鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ?qū)岱€(wěn)定，則需加入終止反應(yīng)液(如加入0．5mol／LEDTA使之在溶液中終濃度到達(dá)10mmol/L)螯合Mg2+，以終止反應(yīng)。另外，還能夠用等體積酚抽提酶解產(chǎn)物，提取DNA。假如用限制性內(nèi)切酶消化DNA分子后，為了進(jìn)行凝膠電泳分析，則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，直接上樣進(jìn)行凝膠電泳?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?7頁(yè)7.利用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行消化詳細(xì)步驟基因工程工具酶限制酶第28頁(yè)限制酶消化反應(yīng)進(jìn)行以下是對(duì)0．2—1．0ugDNA進(jìn)行消化經(jīng)典反應(yīng)步驟，如要對(duì)更大量DNA進(jìn)行消化，則反應(yīng)各個(gè)成份須對(duì)應(yīng)放大。1)將DNA溶液加入一滅菌微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18ul。2)加入2ul適當(dāng)10X限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。3)加入1—2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之。

1單位酶通常定義為，在提議使用緩沖液及溫度下，在20u1反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使lugDNA完全消化所需酶量?；蚬こ坦ぞ呙赶拗泼傅?9頁(yè)4)將上述混合反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需時(shí)間進(jìn)行溫育。5)加入0．5mol／LEDTA(pH8．0)使終濃度達(dá)1