高滲處理對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化平菇菌絲體的影響

高滲處理對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化平菇菌絲體的影響,等首先把農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用于真菌的遺傳轉(zhuǎn)化,以真菌的分生孢子和菌絲為受體,告成地將轉(zhuǎn)入泡盛曲霉、哈茨木霉、粗糙脈胞菌和雙孢菇中[1];等利用提升的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對雙孢菇子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并獲得告成[2];2022年,等同樣用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了雙孢菇的菌絲體和擔(dān)孢子萌發(fā)菌絲,獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子[3];但上述方法中轉(zhuǎn)化效率相對較低,獲得的轉(zhuǎn)化子大片面不穩(wěn)定。

在傳統(tǒng)的基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法中,大量植物及外植體在轟擊轉(zhuǎn)化前經(jīng)滲透處理都有助于提高轉(zhuǎn)化效率[47],因此,山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)測驗(yàn)室通過對平菇菌絲體進(jìn)行高滲處理以及與農(nóng)桿菌共培育時(shí)間等條件的探究,篩選出平菇菌絲體轉(zhuǎn)化的最正確條件。

本文格式為版,下載可任意編輯—2—菌株-2由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院萬魯長老師贈(zèng)送;根癌農(nóng)桿菌105菌株由中國農(nóng)業(yè)高校張力群老師惠贈(zèng);含有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒1302由山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)測驗(yàn)室保存。

:馬鈴薯200,葡萄糖15,瓊脂15。

選擇培育基:培育基中參加不同濃度的潮霉素公司。

液體培育基:胰蛋白胨10,10,酵母提取物5,~。

固體培育基:液體培育基中參加15瓊脂。

本文格式為版,下載可任意編輯—4—誘導(dǎo)培育基:液體培育基中參加乙酰丁香***,溶于二***亞砜中,工作濃度為200μ。

共培育誘導(dǎo)培育基:葡萄糖5;2;47;;;;;2;瓊脂20;~。

使用前參加溶于二***亞砜的,工作濃度為200μ。

℃培育5進(jìn)行活化,然后分別接種于含有50、60、70、80、90、100、200μ潮霉素的平板,以不含潮霉素的平板為對比,置于28℃恒溫培育箱培育,每天查看菌絲生特長境,以篩選中添加潮霉素的適合濃度。

任艷,等:[8],將菌液涂于平板上含有100μ卡那霉素,28℃倒置培育,2后挑取農(nóng)桿菌單菌落,接種于5液體培育基中,200、28℃過夜培育。

次日,按1%的接種量將過夜培育的菌液接種到嶄新的誘導(dǎo)培育基中,28℃培育5~6至~。

本文格式為版,下載可任意編輯—4—,25℃培育5,選擇菌落邊緣生長平勻的菌絲,,為變更細(xì)胞內(nèi)外滲透壓,山梨醇等體積混合液中。

將與混合液的作用時(shí)間設(shè)20、40、603個(gè)處理。

處理完畢后將菌絲體外觀的水分用無菌濾紙充分吸干。

,,28℃、150進(jìn)行共培育,時(shí)間設(shè)20、40、603個(gè)處理,每處理設(shè)3次重復(fù)。

,28℃培育2,然后向其中倒入一層約15的選擇培育基,28℃持續(xù)培育,每天查看菌絲生特長境,實(shí)時(shí)挑取新生菌絲為制止重復(fù),每個(gè)平菇菌塊挑取一次,并再次轉(zhuǎn)接到選擇培育基平板上,連續(xù)培育7,正常生長的平菇菌絲體為轉(zhuǎn)化子,統(tǒng)計(jì)各處理組轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

,下載可任意編輯—6—轉(zhuǎn)化子在普遍平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接15代后再接入到選擇培育基平板上,查看菌絲生長狀況,與普遍平板上菌絲生長全都的是可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。

[9,10]的方法提取3個(gè)抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子總,以其為模板,以:3’:5’3’為引物由上海生工生物工程有限公司合成擴(kuò)增中潮霉素抗性基因,以非轉(zhuǎn)化子為陰性對比,以質(zhì)粒1302為陽性對比。

回響體系為:,緩沖液,,,10μ,2。

回響條件為:94℃預(yù)變性4;94℃變性1,58℃復(fù)性1,72℃延遲2,35個(gè)循環(huán);72℃延遲10。

%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測,凝膠成像系統(tǒng)照相。

。

潮霉素抗性基因的制備:以1302質(zhì)粒為模板,和作為引物,擴(kuò)增潮霉素抗性基因,然后回收純化產(chǎn)物用以制備探針。

本文格式為版,下載可任意編輯—6—突變體基因組酶切電泳:以限制性內(nèi)切酶酶解質(zhì)粒1302為陽性對比,以原始菌株為陰性對比,利用酶切平菇轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子的總基因組,%瓊脂糖在20電壓下電泳過夜。

從凝膠中轉(zhuǎn)移至尼龍膜的步驟依據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。

基因片段探針標(biāo)記,膜的預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色等步驟均按公司說明書進(jìn)行。

,潮霉素對平菇菌絲體的生長速度有較大影響,當(dāng)濃度為30μ時(shí),菌絲生長緩慢;當(dāng)濃度為50、70μ時(shí),菌絲生長受到抑制;當(dāng)濃度為100、200μ時(shí),菌絲中斷生長。

為了降低轉(zhuǎn)化子的假陽性率,在平菇轉(zhuǎn)化測驗(yàn)中,選取200μ潮霉素作為選擇培育基的篩選濃度。

,結(jié)果見表1。

本文格式為版,下載可任意編輯—7—9個(gè)處理中,1、2菌絲體與農(nóng)桿菌的共培育時(shí)間少于60,農(nóng)桿菌未能與菌絲體進(jìn)行充分有效的結(jié)合,轉(zhuǎn)化子數(shù)量較少;4、5中,由于菌絲體預(yù)處理時(shí)間較長,雖然與農(nóng)桿菌作用時(shí)間缺乏60,但在滲透壓作用下轉(zhuǎn)化子數(shù)量較多;7、8、9由于菌絲體處理時(shí)間過長,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不成恢復(fù)性死亡,轉(zhuǎn)化子數(shù)量最少。

3與6得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)量最多,兩者之間無差異,但是3的總用時(shí)80比試驗(yàn)6的100短,所以3為最正確轉(zhuǎn)化條件。

表1高滲處理和共培育時(shí)間對轉(zhuǎn)化子數(shù)目的影響1編號高滲處理菌絲體時(shí)間,下載可任意編輯—8—;大小寫英文字母表示;,,因此這些轉(zhuǎn)化子都是可穩(wěn)定遺傳的。

,從10個(gè)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子中選取的3個(gè)轉(zhuǎn)化子,第2~4泳道,而以未轉(zhuǎn)化的原始菌株為模板擴(kuò)增,沒有條帶消失第1泳道,初步證明基因插入到轉(zhuǎn)化子染色體基因組內(nèi)。

本文格式為版,下載可任意編輯—9—,3個(gè)轉(zhuǎn)化子樣品中均產(chǎn)生了雜交帶第3~5泳道,而陰性對比非轉(zhuǎn)化子未產(chǎn)生任何雜交信號第1泳道,陽性對比質(zhì)粒產(chǎn)生了與探針雜交信號帶第2泳道,這證明白基因已整合到轉(zhuǎn)化子基因組中。

泳道:分子量標(biāo)記;泳道1:陰性對比非轉(zhuǎn)化子;泳道2~4:平菇轉(zhuǎn)化子;泳道5:陽性對比質(zhì)粒:;1:;2~4:;5::陰性對比非轉(zhuǎn)化子;2:陽性對比質(zhì)粒;3~5:平菇轉(zhuǎn)化子1:;2:;3~5:,下載可任意編輯—10—本試驗(yàn)討論結(jié)果表明,當(dāng)平菇菌絲體高滲處理20、與農(nóng)桿菌共培育60時(shí),轉(zhuǎn)化效率高且用時(shí)較少,為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化平菇菌絲體的最佳轉(zhuǎn)化條件。

本討論中平菇菌絲體的高滲處理和與農(nóng)桿菌共培育是關(guān)鍵步驟,這可能是由于高滲處理后細(xì)胞內(nèi)形狀成壓力差,細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分別,液泡變小,此時(shí)再與充分誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌混合,能有效的促使農(nóng)桿菌吸附在細(xì)胞表面,并借助此壓差更易轉(zhuǎn)入到平菇菌絲細(xì)胞