臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢

臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCR或RT-PCR試劑盒的組成核酸提取試劑核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測同時完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素:原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素：擴(kuò)增所需的原材料寡核苷酸引物和探針緩沖液和dNTP聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等PCR反應(yīng)混合物寡核苷酸引物和探針其對試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。純度的判斷可根據(jù)260/280吸光度比值來判斷，如＜2.0,則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上的帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。是否有污染。結(jié)合特異性（濃度）dNTP和緩沖液dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）的濃度緩沖液：在儲存和擴(kuò)增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須的Mg++（或用于rTth的Mn++）的濃度以及pH等逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶酶的濃度酶的活性核酸擴(kuò)增方法PCRRT－PCR轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增（TMA）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）鏈替代擴(kuò)增（SDA）等影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素：核酸提取核酸提取的有效性核酸提取的簡便性影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素：產(chǎn)物檢測雜交固相特異探針及其標(biāo)記物影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素:原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)外在因素：試劑盒的運(yùn)輸和貯存外在因素：試劑盒的運(yùn)輸和貯存試劑盒的運(yùn)輸和貯存PCR試劑盒的有效期一般為6個月，這是指在適當(dāng)?shù)馁A存溫度下。核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20℃下；產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于2?8℃。試劑盒從廠家到用戶手中，均要經(jīng)歷運(yùn)輸及運(yùn)輸中的貯存，任一環(huán)節(jié)的不當(dāng)，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。PCR試劑盒的分類定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標(biāo)和TaqMan等）定量測定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor熒光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。PCR試劑盒的選用原則參考試劑生產(chǎn)廠家的信息廣告參考同行對有關(guān)試劑盒的使用效果參考有關(guān)機(jī)構(gòu)的綜合評價根據(jù)使用目的根據(jù)所在實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)特點(diǎn)根據(jù)所在醫(yī)院患者的承受能力PCR試劑盒的質(zhì)檢外包裝：廠家名稱、檢測目的、批準(zhǔn)文號、批號和有效期等。內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。PCR試劑盒的質(zhì)檢采用血清（樣本）盤（Panel）質(zhì)檢：PCR試劑血清（樣本）盤由一定數(shù)量的原血清陰、陽性樣本、2?3份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及3?5份系列稀釋陽性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。原血清樣本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷DNA擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄及DNA擴(kuò)增的有效性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下限。試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)算公式試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)算公式靈敏度(