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動物克隆第1頁動物細胞與組織培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法單克隆抗體細胞核移植動物克隆常用技術動物細胞融合動物克隆技術基礎是動物細胞與組織培養(yǎng)細胞工程主要伎倆是細胞培養(yǎng)和細胞融合第2頁資料：培養(yǎng)細胞生存環(huán)境

1.無菌、無毒環(huán)境：添加一定量抗生素，定期更換培養(yǎng)液2.合適溫度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.氣體環(huán)境（CO2培養(yǎng)箱）4.特殊培養(yǎng)液：主要有：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等調(diào)整PH，模擬人和哺乳動物細胞在體內(nèi)最適環(huán)境思考：較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？1.液體培養(yǎng)基；2.葡萄糖.3、動物血清含激素，確保細胞順利生長增殖第3頁細胞全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)成果取得細胞或細胞產(chǎn)物培育新植株等培養(yǎng)目葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成份液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物細胞和動物細胞培養(yǎng)比較第4頁一、動物細胞培養(yǎng)首先，將動物體內(nèi)一部分組織取出，通過機械消化或胰酶消化，使其分散成單個細胞；然后，在人工控制培養(yǎng)條件下，使這些細胞得以生存，并保持生長、分裂乃致接觸抑制和有規(guī)律衰老、死亡性能等生命活動現(xiàn)象。注意：細胞之間在生命活動中互相依存，因此也像體內(nèi)同樣展現(xiàn)一定組織特性。第5頁細胞貼壁細胞貼壁：細胞培養(yǎng)時，懸液中分散細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。在培養(yǎng)過程中，細胞會構造和功能變化第6頁細胞在貼壁生長過程中,伴隨細胞分裂,數(shù)量不停增加,最后形成一種單層,此時細胞間互相接觸,細胞分裂和生長停頓。接觸抑制第7頁第8頁成纖維細胞型：第9頁思考幾個問題1、在大多數(shù)細胞培養(yǎng)中都不直接使用人皮膚作為材料而是選用動物胚胎或幼齡個體器官或組織,為何？2、為何培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？3、胰蛋白酶作用？胃蛋白酶能夠嗎？4、為何要分裝？5、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最后培養(yǎng)成新個體？培養(yǎng)細胞會因細胞密度過大和代謝消耗引發(fā)營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新動物個體由于這些組織或器官上細胞生命力旺盛，分裂能力強成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)第10頁有關概念原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)細胞為原代細胞。一般是指從開始到傳至10代細胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：將原代細胞提成若干份，接種到其他培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長繁殖。傳代培養(yǎng)一般指10-50代細胞培養(yǎng)第11頁細胞原代培養(yǎng)

將動物機體多種組織從機體中取出，經(jīng)多種酶（常用胰蛋白酶）或機械辦法處理，分散成單細胞，置合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

第12頁胰酶消化法1、取材：用手術剪將組織剪成小塊（1mm2），再洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細胞。6、靜置，使未分散組織塊下沉。7、吸取上層細胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個培養(yǎng)皿中，補加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。第13頁（一）培養(yǎng)細胞生命期在培養(yǎng)中連續(xù)增殖和生長時間。

第14頁1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點：細胞呈活躍移動、可見細胞分裂、形態(tài)構造和功能活動上與體內(nèi)原組織相同性、多呈二倍體核型細胞群是異質(zhì)，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。第15頁2．傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期連續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸遲緩，以至完全停頓，細胞進入第三期。第16頁3．衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點，由于某種原因影響，細胞也許發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標志之一是細胞也許取得永生性或惡性。第17頁細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。無限細胞系形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工辦法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后細胞也也許具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。第18頁細胞懸液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)總結多呈二倍體核型細胞群是異質(zhì)傳代后稱做細胞系轉(zhuǎn)化細胞也許取得永生性或惡性—異體致瘤永生性也稱不死性，又稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系，大多變成異倍體有限細胞系（二倍體）第19頁細胞系、細胞株細胞株：通過一定選擇或純化辦法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中取得具有特殊性質(zhì)細胞，稱為細胞株。特點：一般具有恒定染色體組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等。連續(xù)細胞株：能夠連續(xù)數(shù)次傳代有限細胞株：可傳代次數(shù)有限細胞系：異質(zhì)性細胞株：純系第20頁★如何取得純系細胞系？把一種細胞從群體中分離出來單獨培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)法）第21頁二、克隆培養(yǎng)法1、克隆培養(yǎng)法概念：把一種細胞從群體中分離出來培養(yǎng)，使之繁殖成一種新細胞群體技術。（克隆培養(yǎng)與群體培養(yǎng)是一種等位概念）2、特性：純系（遺傳性狀均一、體現(xiàn)性狀相同）3、基本要求：必須確保分離出來細胞是一種而不是多種。4、克隆難易程度:單細胞不如群體細胞原代細胞、有限細胞系＜連續(xù)細胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細胞5、提升克隆形成率措施：選擇合適培養(yǎng)基、添加血清（胎牛血清）、滋養(yǎng)細胞（如經(jīng)射線照射本身是去增值力小鼠成纖維細胞）、激素（胰島素等）刺激、CO2培養(yǎng)箱、調(diào)整PH值等6、用途：如從一般細胞系中分離出缺乏特殊基因突變細胞系。第22頁三、動物細胞融合技術及其應用★

什么是細胞融合技術？★

為何要進行細胞融合？★

如何實現(xiàn)細胞融合？第23頁

定義

指用自然或人工辦法,使兩個或多種不一樣細胞融合成一種細胞過程。

不一樣基因型細胞之間融合就是細胞雜交。1、動物細胞融合受精作用兩個細胞正在融合第24頁

誘導融合原因生物法：滅活仙臺病毒誘導融合利用滅活仙臺病毒是動物細胞融合所特有。這是由于病毒磷脂外衣與動物細胞膜十分相同緣故。病毒外殼上某些糖蛋白也許尚有促進細胞融合功能?；瘜W法：聚乙二醇誘導融合由于聚乙二醇易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定，是目前應用最廣泛辦法。物理法：電刺激誘導融合病毒顆粒黏附細胞表面細胞膜連接細胞膜被病毒顆粒穿通細胞融合、形成雜種細胞第25頁5、應用1.由于細胞雜交中染色體容易丟失，因此利用雜交細胞檢測特定染色體丟失與特定基因產(chǎn)物減少對應關系，能夠進行基因定位。3.利用雜交瘤技術，制備單克隆抗體。2.克服遠緣雜交不親和障礙鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等此技術有什么缺陷和長處？第26頁小鼠單克隆抗體制備第27頁雜交瘤制備融合前準備工作細胞融合雜交瘤細胞篩選單克隆抗體大量制備第28頁主要設備

凈化工作臺

超凈工作臺是一種無菌操作裝置，其原理是內(nèi)設鼓風機，驅(qū)動空氣通過高效濾器凈化后，讓凈化后空氣漸漸通過臺面空間，使工作場地組成無菌環(huán)境。組織培養(yǎng)材料準備第29頁主要設備

CO2恒溫培養(yǎng)箱

骨髓瘤和雜交瘤細胞培養(yǎng)都需要在恒定溫度條件下才能生存，溫度變化一般不應超出0.5度。因此要求培養(yǎng)箱應具有較高敏捷度；電熱恒溫箱質(zhì)量關鍵在于控溫裝置優(yōu)劣。CO2恒溫培養(yǎng)箱已成為普遍應用設備，長處是箱內(nèi)能恒定地提供一定量二氧化碳，一般用5%，可使培養(yǎng)液維持穩(wěn)定pH，減少調(diào)pH麻煩。組織培養(yǎng)材料準備第30頁主要設備

離心機培養(yǎng)細胞經(jīng)常需要制備細胞懸液、漂洗，需離心分離細胞，要求每分1000轉(zhuǎn)左右，故一般小型臺式離心機即符合要求。組織培養(yǎng)材料準備第31頁主要設備

培養(yǎng)液過濾裝置

多種培養(yǎng)用液只能用過濾辦法進行除菌做消毒處理。現(xiàn)多用微孔濾膜，密度有不一樣型號，尺寸有不一樣規(guī)格。組織培養(yǎng)材料準備第32頁主要設備

多孔培養(yǎng)板、塑料器皿

組織培養(yǎng)材料準備第33頁骨髓瘤細胞懸液制備骨髓瘤細胞擴大培養(yǎng)50ml離心管1000r/min離心5-10min離心洗滌骨髓瘤細胞懸液活細胞計數(shù)后備用融合前48-36h融合當天30ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺盼藍染液

第34頁脾細胞懸液制備小鼠脾臟直徑10cm平皿剝離周圍結締組織

剪刀剪碎、注射器芯擠壓單細胞懸液直徑10cm平皿10ml不完全培養(yǎng)基

銅網(wǎng)過濾

10ml不完全培養(yǎng)基

輕輕洗滌

第35頁脾細胞懸液制備脾細胞懸液1000r/min離心5-10min離心洗滌1-2次脾細胞懸液活細胞計數(shù)后備用50ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺盼藍染液

第36頁1234mmmm12341234單克隆抗體細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細胞抗原免疫小鼠后，其脾臟會產(chǎn)生分泌抗體多種B細胞。每種B細胞只能分泌一種抗體，反抗各自抗原決定基。傳統(tǒng)抗血清便是所有抗體混合，得以有效保護動物個體。假如能夠把單一種B細胞挑出來培養(yǎng)，則可收獲單一種抗體。不過，B細胞無法在試管中培養(yǎng)生長。癌細胞可以在試管中連續(xù)培養(yǎng)生長，但無法產(chǎn)生所要抗體。這些單獨融合細胞能夠大量生產(chǎn)單獨一種抗體，就是單克隆抗體。若把B細胞與癌細胞融合，所得到融合細胞則可分別培養(yǎng)。第37頁骨髓瘤細胞致敏B淋巴細胞雜交瘤第38頁骨髓瘤細胞脾細胞雜交瘤細胞融合后細胞類型:

雜交瘤技術理論基礎融合細胞篩選技術第39頁融合細胞篩選技術生化代謝缺陷型骨髓瘤細胞系單克隆抗體產(chǎn)生原理HAT培養(yǎng)基根據(jù)篩選雜交瘤細胞特殊培養(yǎng)液。

第40頁融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況不能長期生長死亡生化代謝正常能夠長期生長生長繁殖死亡生化代謝缺陷能夠長期生長生化代謝正常第41頁雜交瘤細胞篩選

脾細胞骨髓瘤細胞細胞融合HAT初步篩選篩選陽性克隆單克隆抗體產(chǎn)生原理第42頁操作步驟篩選陽性細胞克隆每孔加待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，同步設置陽性（免疫鼠血清）、陰性對照（完全培養(yǎng)基）和空白對照。第43頁單克隆抗體大量制備動物體內(nèi)生產(chǎn)法體外培養(yǎng)法小鼠腹水誘導細胞培養(yǎng)液第44頁制備雜交瘤培養(yǎng)上清

雜交瘤細胞擴增1:10百分比轉(zhuǎn)入新瓶離心、搜集上清檢測抗體滴度分裝、無菌保存

37℃5％CO2

5d

第45頁制備單克隆抗體腹水

動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗是最實用大量制備單抗辦法。使用動物首選BALB/c小鼠。原理：將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量腹水單抗且抗體濃度很高。注射細胞前一般先用降植烷或液體石蠟處理腹腔，方便產(chǎn)生大量腹水。缺陷：腹水中?；煊行∈蠖喾N雜蛋白（包括Ig）；有污染動物病毒危險。第46頁制備單克隆抗體腹水

腹腔接種降植烷或液體石蠟（0.5-1ml/只）

7-10天腹腔接種無血清培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細胞，5×105/只

第47頁制備單克隆抗體腹水

7-10天采集腹水2023r/min，5min搜集上清，測定抗體效價分裝，凍存?zhèn)溆?/p>

第48頁第49頁思考：（1）為何用小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合？

細胞同源性越近，融合形成雜種細胞越易成活。繼承了雙親細胞遺傳物質(zhì)，不但具有B細胞分泌抗體能力，并且尚有沒有限增殖本事，因而能夠取得大量單克隆抗體。（2）骨髓瘤細胞是癌細胞嗎？有沒有限增殖能力細胞是腫瘤細胞，而具有轉(zhuǎn)移能力腫瘤細胞，稱為癌細胞，因此瘤細胞不能等同于癌細胞。（3）制備過程為何要通過兩次篩選？

第一次篩選取得多種雜交瘤細胞第二次篩選出特異抗體雜交瘤細胞。(5)本過程利用了哪些原理？免疫原理、細胞融合原理、動物細胞培養(yǎng)原理（4）制備過程中應用哪些細胞工程技術伎倆？

細胞融合技術、細胞培養(yǎng)技術。第50頁動物細胞融合技術B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜交瘤細胞才能活動物細胞培養(yǎng)技術取得產(chǎn)生對應抗體B淋巴細胞取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細胞取得雜交瘤細胞第51頁1975年，米爾斯坦（英）和科勒（德）融合選擇性培養(yǎng)基抗體檢測問題探究1.第一次篩選和第二次篩選目標有何不一樣？2.單克隆抗體有何特點？單克隆抗體長處：化學性質(zhì)單一，特異性強，敏捷度高。第一次篩選：用選擇性培養(yǎng)基取得雜交瘤細胞。第二次篩選：通過抗體檢測取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細胞。第52頁四、動物克隆繁殖★理論上，分化動物細胞能像植物細胞同樣脫分化、再分化成一種動物體嗎？★動物細胞事實上體現(xiàn)出全能性情況如何呢？第53頁受精卵>胚胎干細胞>多能干細胞>單能干細胞>體細胞四、動物克隆繁殖（一）動物細胞全能性體現(xiàn)程度如多能造血干細胞：可分化為紅細胞、白細胞、血小板等（2）低等動物細胞：全能性一般容易體現(xiàn)。如水螅上皮細胞，不通過度裂就能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?、肌肉細胞。?）高等動物細胞第54頁（二）動物難以克隆主線原因

在動物個體發(fā)育過程中，分化成果使得細胞在形態(tài)和功能上高度特化，這是由于細胞在伴伴隨它們發(fā)育過程中在時間、空間變化，基因體現(xiàn)調(diào)控使得細胞中合成了專一蛋白質(zhì)。動物基因組中，一類基因是維持生存，在多種細胞中都處于活動狀態(tài)。另一類基因伴隨組織器官和發(fā)育階段不一樣而選擇性體現(xiàn)。分化細胞內(nèi)基因活動很不完全，因此很難像受精卵那樣發(fā)揮細胞全能性。第55頁胚胎細胞核移植成功率遠高于成體細胞(三)細胞核移植試驗和動物克隆繁殖1、過程：利用一種細胞細胞和來取代另一細胞中細胞核，形成一種重建“合子”胚胎細胞核移植體細胞核移植第56頁綿羊“多莉”克隆過程：第57頁詳細操作取6歲母綿羊（芬蘭多塞特白品種綿羊）乳腺細胞作核供體細胞，用“饑餓法”使其進入休眠狀態(tài)而使所有基因具有活性。注射促性腺激素GN促使母羊（蘇格蘭黑面母綿羊）排卵，28－33小時取其未受精卵迅速去核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，饑餓使進入G0期做受體細胞。

第58頁在乳腺細胞與無核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流作用下，將乳腺細胞核融入卵中，形成一種具有新遺傳物質(zhì)卵細胞。將新卵細胞發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊復制品，也為白色。第59頁①供體和受體準備核移植成功主要前提：盡可能確保核供體和受體細胞處于同樣細胞周期（同步狀態(tài)）

如何使處于細胞周期不一樣階段上核供體和受體處于同步狀態(tài)？第60頁饑餓技術即在供體細胞培養(yǎng)基中減少營養(yǎng)物質(zhì)（血清）濃度，使供體細胞處于“饑餓狀態(tài)”，停頓分裂增殖而休眠。休眠細胞核進入去核卵細胞后，在卵細胞細胞質(zhì)作用下重新啟動分裂程序。這樣，供體細胞核與受體細胞質(zhì)才能在分裂相上互相協(xié)調(diào)，配合細胞才能分裂發(fā)育。第61頁②去卵膜和卵核如何給受體細胞去核？◆顯微操作

◆紫外照射◆細胞松弛素結合高速離心

第62頁第63頁③供體細胞制備如何獲取供體細胞核？◆

顯微操作

◆細胞松弛素結合高速離心核體胞質(zhì)體第64頁二、克隆技術辦法將受體卵細胞

去核向去核卵細胞植入供體細胞移植后細胞激活后能夠象受精卵同樣發(fā)育形成動物個體，并具有與核供體細胞相同基因④移核第65頁⑤移植后重組細胞激活、培養(yǎng)、胚胎移植◆激活（P52）（使卵母細胞從MII期解放，轉(zhuǎn)到“受精”狀態(tài)）◆重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)◆胚胎移植

第66頁重構卵激活正常情況下,受精過程中，精子進入卵子后,卵母細胞質(zhì)中會出現(xiàn)一系列反應,如母源性mRNA啟動轉(zhuǎn)錄等。這些反應是卵母細胞被激活標志，不通過這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過程中激活就是模仿受精過程中精子刺激作用。目前，激活方式主要有：電激活和化學激活第67頁顯微操作法進行細胞核移植第68頁克隆羊成功分子細胞生物學機理：

供體核DNA中有起源于乳腺細胞細胞質(zhì)調(diào)整蛋白，它制止了核基因體現(xiàn)。重組卵細胞，基因轉(zhuǎn)錄沒開始，無調(diào)整蛋白重組移核細胞丟失了源于乳腺細胞調(diào)整蛋白。通過三次分裂后，原乳腺細胞調(diào)整蛋白便所有被卵細胞質(zhì)中蛋白因子替代了，因此核DNA被重新編排，細胞開始體現(xiàn)自己基因。第69頁體細胞克隆成功意義：1、證明了高度分化細胞也能夠回復到類似受

精卵時期功能。2、證明了細胞質(zhì)具有調(diào)控細胞核發(fā)育作用。應用：

為遺傳疾病治療、優(yōu)良品種培育等提供了主要途徑；對瀕危動物保存也有主要意義。克隆成功條件（必備基礎）P201、具有包括物種完整基因組細胞核活細胞。(如乳腺上皮細胞)2、能有效調(diào)控細胞核發(fā)育細胞質(zhì)物質(zhì)。（如去核卵細胞