榆樹桂枝病病原鑒定及離體水培培養(yǎng)研究

榆樹桂枝病病原鑒定及離體水培培養(yǎng)研究

0松樹枝條枯病鑒定這項(xiàng)工作表明，在中國東北的森林大學(xué)里發(fā)現(xiàn)了一種蝗蟲病，該菌株被鑒定為呈火禽狀的黑葡萄腔(。由Theissen&Sydow(1915)建立,根據(jù)形態(tài)特征被認(rèn)為與1材料和方法1.1榆樹枝條病病原菌觀察及分離2019年4月,從東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)觀察到榆樹枯枝病病害枝條,采集具有典型病癥的標(biāo)本用紙質(zhì)信封密封包好帶回實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行病原菌觀察及病原菌分離。1.21.2.1病原菌分離培養(yǎng)用75%的酒精棉擦拭發(fā)病榆樹枝條表面,用無菌刀切取榆樹發(fā)病枝條上帶有分生孢子器的發(fā)病組織為分離材料,在超凈工作臺(tái)下接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行病原菌分離。將接種后的培養(yǎng)皿放入25℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2d后,挑取菌落邊緣菌絲接種至PDA平板連續(xù)純化3次,并將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面試管中,放置4℃冰箱中保存。1.2.2種和無傷接種法檢測培養(yǎng)過程中培養(yǎng)方為選取健康無病害粗細(xì)相等的榆樹枝條進(jìn)行離體水培培養(yǎng)。根據(jù)柯赫氏法則定,采取針刺接種、燒傷接種和無傷接種法進(jìn)行接種試驗(yàn)。在刺傷、燒傷和無傷處理的榆樹枝條上覆蓋直徑7mm的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的該病害菌餅,用浸有無菌水的紗布和嫁接膜保濕培養(yǎng)48h,重復(fù)10組。以針刺、燒傷和無傷接種無菌水做空白對照,各重復(fù)10組。將處理后的樹枝做好標(biāo)記室溫下培養(yǎng),觀察發(fā)病情況。1.2.3檢查枝條枯萎的病原體取帶有榆樹枯枝病病原菌子實(shí)體的標(biāo)本進(jìn)行切片,制成臨時(shí)水載片,在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的形態(tài)特征及其大小。1.2.4植酸質(zhì)量檢測將病原菌菌株接入PDA培養(yǎng)基上,在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,收集菌絲體,選取北京擎科生物有限公司生產(chǎn)的No.TSE011200rxns快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(2×T5DirectPCRKit(Plant)),提取菌絲真菌基因組DNA。rDNA-ITS區(qū)段分析采用通用序列引物ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4:(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′)對樣品的rDNAITS1-ITS4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系,模板DNA1μL,引物各1μL,2×T5DirectPCRMix(Plant)25μL,滅菌ddH2結(jié)果與分析2.1分生孢子器形態(tài)檢測致病性測定結(jié)果表明,燒傷接種病原菌的榆樹枝條45d后在接種的榆樹枝條上長出了分生孢子器,其癥狀表現(xiàn)與野外采集的發(fā)病枝上癥狀相一致,將發(fā)病組織中分離的病原菌形態(tài)與野生型病原菌形態(tài)進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)其與野生病原菌形態(tài)一致。刺傷、無傷接種病原菌和對照組均不發(fā)病(表1,圖2)。2.2松樹枝條枯病病原菌分離培養(yǎng)pa對自然發(fā)病的榆樹枝條切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察,分生孢子器初埋生,成熟后突破樹皮外露,黑色,表面扁球形,孢子成熟后從孔口噴出大量分生孢子并附著在樹皮表面成黑色。分生孢子器為單腔球形,分生孢子器外徑為350～450μm,內(nèi)徑為188～275μm。器壁黑色至無色,側(cè)面黑色器壁由12～20層細(xì)胞組成,無色器壁由6～11層細(xì)胞組成;產(chǎn)孢細(xì)胞由分生孢子器無色器壁細(xì)胞形成。產(chǎn)孢方式為全壁芽生單生式,產(chǎn)孢細(xì)胞之間有許多細(xì)長的無色絲狀菌絲;分生孢子初期單胞、無色、短小、壁薄,成熟的孢子暗色、雙胞和分隔處縊縮、孢子近等大、孢子兩端鈍圓,偶有一端平截、大橢圓形。分生孢子大小為(22.5～27.5)μm×(10.0～15.0)μm(榆樹枯枝病病原菌在PDA培養(yǎng)基上,菌落白色絨毛狀,7d左右菌絲長滿平板,菌落顏色開始由白色變成黑色;在黑暗處培養(yǎng)10d后,見光處理50d后,培養(yǎng)基上出現(xiàn)分生孢子器,單生,球狀,埋生至半埋生,黑色。切片觀察其形態(tài)特征與野生型病原菌形態(tài)特征一致。2.3植生混凝土測序結(jié)果將提取的病原菌(編號(hào)為Y1)rDNA-ITS基因片段測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對,對比結(jié)果顯示r