博來霉素給藥途徑的選擇

博來霉素給藥途徑的選擇

肺纖維化是一種以肺壁細(xì)胞浸潤、增厚和間質(zhì)纖維為特征的系統(tǒng)性疾病。中醫(yī)古籍中沒有與肺纖維化完全對應(yīng)的病名,據(jù)其臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰,后期出現(xiàn)進(jìn)行性加重呼吸困難等癥狀,且呈慢性、反復(fù)發(fā)作,多數(shù)學(xué)者將其歸為“肺痿”“肺痹”“肺脹”“絡(luò)病”“喘證”“咳嗽”等范疇,肺痹與肺痿最為多見目前用于建立肺纖維化動物模型的誘導(dǎo)劑有博萊霉素1材料表面1.1動物1.3儀器2方法2.1動物模型的制備2.2生命狀態(tài)和體重監(jiān)測3多次霧化和單次氣管灌注大鼠肺纖維化模型空白組大鼠給予生理鹽水后,生長正常,精神、食欲均良好。單次氣管灌注組、多次氣管灌注組、單次靜脈注射組、多次靜脈注射組、單次霧化吸入模型組和多次霧化吸入模型組給予博來霉素后,第1周表現(xiàn)出行動遲緩,精神萎靡,毛色不佳;第2周表現(xiàn)出毛發(fā)少量脫落;第3周表現(xiàn)出背部毛發(fā)晦暗,顏色米黃,無光澤;第4周表現(xiàn)出毛發(fā)蓬松稀疏,弓背,體弱,尤以多次氣管灌注組最嚴(yán)重。對上述各種給藥方式致大鼠肺纖維化模型比較,發(fā)現(xiàn)單次氣管灌注組(26.7%)和多次氣管灌注組(20%)大鼠的死亡率最高,多次靜脈注射組出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象,單次霧化模型組和多次霧化模型組大鼠生存狀態(tài)稍優(yōu)于其他模型組。另外,多次霧化模型組有一只大鼠死亡,是因?yàn)樵囼?yàn)操作不當(dāng),而不是藥物和給藥方式本身的作用。見表3。空白組體質(zhì)量呈遞增趨勢。單次氣管灌注組、多次氣管灌注組、單次靜脈注射組、多次靜脈注射組、單次霧化吸入模型組和多次霧化吸入模型組3d內(nèi)體質(zhì)量下降明顯,5d左右變化趨于平緩,5d后開始逐日遞增。其中,多次靜脈注射組總體增長趨勢較其他模型組緩慢,單次靜脈注射組3d內(nèi)體質(zhì)量急劇下降,最嚴(yán)重的大鼠體質(zhì)量減輕35g,達(dá)到總體質(zhì)量的18%。最后在給藥后28d,各組大鼠的體質(zhì)量均無顯著性差異。見圖2。3.2不同動物肺間隔的平均變化空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,部分肺間隔輕微或輕度增厚,間質(zhì)可見少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤;而造模大鼠可見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤,肺泡壁增厚及肺泡間隔增寬,在肺間質(zhì)區(qū)域可見成纖維細(xì)胞聚集和膠原基質(zhì)沉積增加,肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。其中單次氣管灌注組、單次靜脈注射組、多次靜脈注射組多數(shù)動物的肺間隔中度增厚,少數(shù)動物的肺間隔輕度增厚,間質(zhì)可見不同程度的慢性活動性炎癥,與空白組比較有明顯差異;多次氣管灌注組部分動物肺間隔重度增厚,間質(zhì)見大量慢性活動性炎癥,部分動物肺間隔中度增厚,間質(zhì)見大量炎癥,2只動物肺間隔輕微增厚,間質(zhì)見少量慢性活動性炎癥,與空白組比較有明顯差異;單次霧化吸入模型組多數(shù)動物肺間隔輕中度增厚,2只動物呈中重度增厚,與空白組比較有加重趨勢;多次霧化吸入模型組多數(shù)動物的肺間隔中度增厚,個(gè)別動物的肺間隔輕度增厚,大部分間質(zhì)可見相同程度的慢性活動性炎癥,與空白組比較差異顯著。見圖3,表5。3.4多次霧化獨(dú)立肺間質(zhì)的變化空白組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常,間質(zhì)未見纖維組織增生,而其余各組造模大鼠肺間隔可見不同程度的增厚,肺間質(zhì)可見不同程度的纖維組織增生。其中多次霧化吸入模型組和多次氣管灌注組之間無明顯差異,多數(shù)動物肺間隔呈中、重度增厚,間質(zhì)可見成團(tuán)的纖維組織增生,甚至肺泡結(jié)構(gòu)消失,形成連續(xù)的纖維化。見圖4,表6。3.5各組p含量的比較多次氣管灌注組、單次霧化吸入模型組和多次霧化吸入模型組大鼠肺組織中HYP含量較空白組顯著升高,而其他各組均無顯著性差異。與空白組比較,單次氣管灌注組、單次霧化吸入模型組和多次霧化吸入模型組大鼠肺組織中PAI-1含量顯著升高,而其他各組PAI-1的含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表7。4hyp和pai-1含量的檢測前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)博來霉素可以經(jīng)尾靜脈注射本研究對氣管灌注、尾靜脈注射、霧化吸入3種給藥方式致大鼠肺纖維化模型進(jìn)行比較。首先,除了病理結(jié)果這個(gè)金指標(biāo)外,筆者選擇肺組織中HYP和PAI-1作為客觀檢測指標(biāo)。HYP是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一(約占13.4%),在彈性蛋白中含量極少,在其他蛋白中均不存在,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。PAI-1是一種尿激酶型纖維蛋白酶原(urokinasetypeplasminogenactivator,u-PA)的關(guān)鍵抑制劑,在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解中發(fā)揮重要的作用,前期研究已證實(shí),PAI-1基因在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠體內(nèi)過度表達(dá)可以加重肺纖維化。綜上所述,本次研究中選擇病理結(jié)果、肺組織中HYP和PAI-1含量作為檢測指標(biāo)。其次,筆者確定了3種給藥方式的給藥濃度。氣管灌注BLM5mg·kg綜上所述,多次霧化吸入BLM(60g·L80只雄性SD大鼠,SPF級,體質(zhì)量(180±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。合格證號SCXK(京)2016-0011。本實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的所有相關(guān)操作均在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物倫理委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行,批準(zhǔn)號20172001。1.2檢測試劑和檢測方法注射用鹽酸博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司,批號分別為17001711,16049011,1603381);生理鹽水(山東花露制藥有限公司,批;大鼠羥脯胺酸(HYP),大鼠纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號分別為w21031643,U08038384);馬松(Masson)三色染色液,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司,批號分別為0413A18,0527A17)。FinePointe型無創(chuàng)氣道動力學(xué)研究系統(tǒng)和FinePointe型暴露塔(美國DSI公司);SpectraMaxi3x型酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices公司);3-18KS型高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);BSA3202S-CW型電子天平(德國Sartorius公司);JXFSTPRP-24型全自動樣品快速研磨儀(上海凈信科技);ADVIA2120型全自動血液分析儀(德國Simens公司);BX51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司);Finesse325型切片機(jī),ExcelsiorES型全自動脫水機(jī),Histocentre3型石蠟包埋機(jī),VaristainGeminiES型全自動染色機(jī)(美國Thermo公司)。雄性SD大鼠80只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3d,采用體質(zhì)量隨機(jī)分組法分為空白組、單次氣管灌注組、多次氣管灌注組、單次靜脈注射組、多次靜脈注射組、單次霧化吸入模型組、多次霧化吸入模型組,共7組,造模方法見圖1。監(jiān)測實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠精神活動、體質(zhì)量變化、進(jìn)食、飲水、毛色和死亡率。2.3肺系數(shù)的檢測給藥后28d,測量各組大鼠的肺濕重,計(jì)算肺系數(shù),肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。2.4組織病理學(xué)評分肺組織經(jīng)固定、脫水,石蠟包埋,制成4μm的切片。肺組織切片經(jīng)HE染色,Masson染色,參照Szapiel等2.5hyp和pai-1的含量用ELISA試劑盒檢測肺組織中HYP和PAI-1的含量