蛋白質(zhì)定量測定方法

試驗 蛋白質(zhì)的定量測定方法【試驗預(yù)習(xí)】試比較Folin酚法與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法的優(yōu)缺點。試比較二喹啉甲酸法與Folin酚法的優(yōu)缺點。凱氏定氮法中在消化樣品時，參加濃硫酸，硫酸鉀和硫酸銅粉末的目的是什麼？紫外吸取法測定蛋白質(zhì)含量的原理是什麼？一、Folin酚試劑法(Lowry法)【試驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)Folin酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理。把握Folin酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的方法和操作?！驹囼炘怼縁olinCu2+作用生成蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物；其次步：蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基復(fù)原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反響在30不同的測定波長：假設(shè)蛋白質(zhì)含量高時〔25100μg〕在500nm波特進(jìn)步行測定，含量低時(525μg)在755nmFolin酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。【試驗用品】試驗器材100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度計。試驗試劑Fo1in酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50mL0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO4?5H2O)溶于100mL1％酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50mL與后者lmL混合?；旌虾?日內(nèi)使用有效。Folin酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中參加100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸餾水、50mL85％磷酸及100mL濃鹽酸，充分混勻后回流10h?；亓魍?50g50mL15冷卻后定容到1000mL中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度為2mol／L左右(由于濾液為淺黃色，滴定時濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點的觀看)。使用時適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最終濃度為lmol／L酸。100溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/mL。樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！痉椒ú襟E】繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表分別參加各試劑各管參加Fo1in30分鐘后比色，在500nm處登記各管光密度，以0號管為比照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in酚試劑乙，馬上搖勻，放置30分鐘，在500nm處測定光密度值。【試驗結(jié)果】依據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量?！玖粢馐马棥苛粢庖獪?zhǔn)確配制所用試劑，準(zhǔn)確量取各溶液?！驹囼瀳蟾妗靠偨Y(jié)試驗結(jié)果，并分析評價試驗結(jié)果。二、紫外吸取法【試驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)紫外吸取法測定蛋白質(zhì)含量的原理。把握紫外分光光度計的操作方法?！驹囼炘怼俊怖野彼岷蜕彼?80nm特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸取法可測定0.1-0.5mg/ml度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用?！驹囼炗闷贰吭囼炂鞑脑嚬芗霸嚬芗?；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度計。試驗試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確配制2mg／mL的酪蛋白溶液。樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！痉椒ú襟E】繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管按以下各表參加各試劑：試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計上，于280nm處以0號管為比照，分別測定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4mL混勻，在280nm下測定其光密度值?！驹囼灲Y(jié)果】依據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量?！玖粢馐马棥苛粢庖獪?zhǔn)確配制所用試劑，準(zhǔn)確量取各溶液?！驹囼瀳蟾妗靠偨Y(jié)試驗結(jié)果，并分析評價試驗結(jié)果。三、凱氏定氮法【試驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)?！驹囼炘怼縿P氏定氮法用于測定有機(jī)物的含氮量,假設(shè)蛋白質(zhì)的含氮量時蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個反響進(jìn)展得比較測物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量?！驹囼炗闷贰吭囼炂鞑奈⒘縿P氏定氮儀1套；50mL凱氏燒瓶4個；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠試驗試劑濃硫酸；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01mol／L)。粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物：KSOCuSO?5HO以3：1配比研磨混合。2 4 4 250mL0.200mL0.合配成，貯于棕色瓶中備用。樣品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品。【方法步驟】安裝凱氏定氮儀。4個50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號,各加11號及2號瓶中各加樣品1mL，催化劑(K2SO4CuSO4?5H2O)200mg，濃硫酸5mL。留意加樣品時應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號及4號瓶中各加1mL蒸餾水和與1、2號瓶一樣量的催化劑和濃硫酸，作為比照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)展消化。在消化開頭時應(yīng)掌握火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開頭分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，連續(xù)消化，直至消化液呈透亮淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。蒸餾：蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中參加用幾滴硫酸酸化的15傾斜放好裝有硼酸指示劑的錐形瓶，連續(xù)蒸汽洗滌2分鐘，觀看錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停頓加熱，翻開夾子。蒸餾：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細(xì)心地插到反響室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一個含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。取30％的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中，輕提棒狀玻璃塞使之流入反響室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反響室必需緩慢)。尚未完全流入時，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中參加蒸餾水約5ml。再輕提玻璃塞，使一半蒸餾水漸漸流入反響室，一半留在玻璃杯中作水封。51厘米，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面，連續(xù)蒸餾1分鐘，移開錐形瓶，用外表皿掩蓋錐形瓶。蒸餾進(jìn)展滴定。0.01moL／L變淡紫色為滴定終點?！驹囼灲Y(jié)果】其中：A為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；B為滴定比照液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；C為所取樣品溶液的mL數(shù)?！玖粢馐马棥苛粢獠灰対饬蛩嵴车揭路蚱つw上?！驹囼瀳蟾妗靠偨Y(jié)試驗結(jié)果，并分析評價試驗結(jié)果，總結(jié)試驗閱歷。四、二喹啉甲酸法(BCA法)【試驗?zāi)康摹堪盐沼肂CA方法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法。【試驗原理】BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡潔，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高〔微量檢測可到達(dá)0.5μg/mL〕，應(yīng)用更加敏捷。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時將Cu2+復(fù)原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸取值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。【試驗用品】試驗器材分光光度計；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。試驗試劑(1)BCA試劑的配制①試劑A，1L：分別稱取10gBCA(1%)，20gNaCO·HO(2%)，1.6gNaCHO·2HO(0.16%)，2 3 2 2446 24gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO(0.95)，加水至1L，用NaOH或固體NaHCOpH值至11.25。3 3②試劑B，50mL：取2gCuSO·5HO(4%)，加蒸餾水至50mL。4 2③BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。40mg100mL，制成400μg/mL的溶液。樣品溶液：配制約50μg/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！痉椒ú襟E】繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支枯燥干凈的大試管，編號，按下表參加試劑。上述試劑加完后，混勻，于37℃保溫30min，冷卻至室溫后，以第1管為比照，在562nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定準(zhǔn)確吸取250μLBCA試劑5mL37℃保溫30min，冷卻至室溫后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號管為比照，在595nm處比色，記錄吸光值?！驹囼灲Y(jié)果】依據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量?！玖粢馐马棥苛粢馕⒘窟M(jìn)樣器的用法，試劑用量少，要準(zhǔn)確量取；留意按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?！驹囼瀳蟾妗靠偨Y(jié)試驗結(jié)果，并分析評價試驗結(jié)果。五、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法【試驗?zāi)康摹堪盐沼每捡R斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法?！驹囼炘怼靠捡R斯亮藍(lán)G250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸取峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成深藍(lán)色，最大吸取峰變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)含量在11000μg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測定。1μg2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時內(nèi)穩(wěn)定。所以本法操作簡便，快速，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種測定蛋白質(zhì)含量的常用方法?！驹囼炗闷贰吭囼炂鞑姆止夤舛扔?；試管；移液管；容量瓶。試驗試劑10mg100mL，制成100μg/mL的溶液。考馬斯亮藍(lán)G250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50mL95％乙醇中，參加85%(m/v)的磷酸100mL，最終用蒸餾水定容到1000mL。此溶液可在常溫下放置一個月。樣品溶液：配制約50μg/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！痉椒ú襟E】繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支枯燥干凈的大試管，編號，按下